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¿Sería posible crear un gel que contenga virus que pudiera alterar el genoma humano cuando se frota?

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Me preguntaba si sería posible diseñar un virus que, cuando entra en contacto con los folículos del cabello humano, pueda alterar el color natural del cabello de alguien. ¿Alguien tiene cabello azul natural?

Sin duda hay muchos problemas, pero esperaba que pudieran identificarse y potencialmente solucionarse.


Catástrofe de armas biogenéticas: virus propagado por la CIA con nano-Uav como Cyber-Dragonfly Eye

De la pandemia a una catástrofe mundial de China a Irán e Italia por un saldo dramático de más de 4 mil muertes, 5 veces las 813 del SARS en 2003. Mientras tanto, la sospecha de que la CIA se extendió con un Cyber ​​Insect u otro tipo de nano-drone, según afirman fuentes de inteligencia.

Aunque CoronaVirus parece absolutamente letal solo para personas mayores o con un sistema inmunológico débil, su propagación está creciendo exponencialmente debido a la facilidad de contagio entre los seres humanos (saliva, aliento, manos) y su resistencia de duración indefinida en superficies y objetos. Es cierto que con un chorrito de etanol u otro desinfectante doméstico se puede matar el virus pero lo preocupante es su fácil regreso.

De hecho, pudo matar tanto al médico héroe chino, Li Wenliang, el oftalmólogo que dio la alarma por primera vez en China en diciembre pasado (esta es la razón del número de código Covid-19), como también al director del hospital de Wuhan. , Li Zhiming.

El primero tenía solo 33 años, el segundo 51, ambos obviamente estaban muy expuestos a esta violenta enfermedad respiratoria, pero ambos también estaban equipados con todas las herramientas médicas necesarias disponibles hasta el momento para combatirla. Cerca de mil médicos están infectados en China y entre ellos, ya hay 6 muertes que confirman que el contacto prolongado con personas infectadas puede ser fatal incluso para individuos con buenos anticuerpos, protecciones adecuadas y tratamientos eficientes.

Dr. Liu Zhiming, director del hospital de Wuhan, fallecido en los últimos días

Todo ello pone de relieve el poder del virus que, a pesar de tener una tasa de mortalidad ahora en torno al 2% y por tanto inferior a los síndromes respiratorios del SARS (7%), tiene una rapidez de contagio en unas zonas trágicamente elevadas y, sobre todo, imparables. Es una cepa viral de la gran familia CoronaVirus: la del resfriado simple & # 8220 común & # 8221, el trastorno del tracto respiratorio superior que incluye resfriado, tos, maldigola, que, sin embargo, puede degenerar en neumonía tan grave que paraliza los pulmones bloqueando así la oxigenación de la sangre.

El Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) ya lo ha rebautizado como Síndrome Respiratorio Agudo Severo CoronaVirus 2 (SARS-CoV-2) dada su peligrosidad ya atestiguada en un artículo detallado publicado por algunos científicos chinos en la edición de febrero de & # 8220Science China Ciencias de la vida ”que resalta anomalías bioquímicas como para inducir al Partido Comunista Chino a considerarlo sin lugar a dudas un arma biológica.

Según otros expertos estadounidenses, se trata de un instrumento de guerra que se salió de las manos en Wuhan, los segundos e independientes analistas chinos fueron construidos y difundidos por algún enemigo de Pekín. Entre los sospechosos número uno se encuentra Estados Unidos que en todo el mundo, especialmente en los países limítrofes con Rusia, China y Medio Oriente, cuentan con al menos 25 laboratorios para la producción de armas biogenéticas, es decir, calibrados en el genoma de algunos. Grupos étnicos. Y algunos 007 confirman que se trata de una epidemia generalizada con nano-drones & # 8230

Además de haber iniciado estudios sobre la manipulación genética de insectos como los vehículos virales como herramientas de defensa o ataque (oficialmente contra plagas en la agricultura), EE. UU. Ya ha creado DragonflEye, la libélula cibernética guiada por luz para vuelos de reconocimiento, polinización dirigida y entrega de & # 8220payload & # 8221. Más adelante veremos en detalle los laboratorios socios del Pentágono que desarrollaron el proyecto, iniciado por la CIA en 1970 con el primer Insecthoper.

Este fue el primer prototipo de & # 8220nano-drone & # 8221 que también ha evolucionado hoy en el Black Hornet 3, el helicóptero UAV de 10 cm ya en uso por el ejército estadounidense y otros países de la OTAN, cuyo kit puede caber en una mochila militar. O un turista que visita un país extranjero & # 8230

CHINA E IRÁN: MÁS MUERTES EN PAÍSES ENEMIGOS DE EE. UU.

El aumento en el número de muertes e infectados con COVID-19 (donde & # 8220CO & # 8221 significa corona, & # 8220VI & # 8221 para virus, & # 8220D & # 8221 para enfermedad y & # 822019 & # 8221 indica el año en el que ocurrió), como lo llamó el Director General de la Organización Mundial de la Salud Tedros Adhanom Ghebreyesus el 11 de febrero de 2020, es tan vertiginoso que ahora ninguna institución o medio de salud en el mundo es capaz de brindar una actualización en tiempo real, por lo tanto , los datos que estamos reportando ya se superarán a la mitad ahora después de su publicación.

Si examinamos el número actual de muertos, vemos que el segundo país más afectado es otro enemigo histórico de Estados Unidos, Irán, en el centro de los recientes enfrentamientos militares por el asesinato del general Qasem Soleimani, comandante de las Fuerzas Quds. del iraní Pasdaran, en una operación del Pentágono y la Agencia Central de Inteligencia, el ataque con misiles de la Guardia Revolucionaria Islámica de Teherán en dos bases estadounidenses en Irak con 109 soldados gravemente heridos por daño cerebral, y el accidente aéreo de la CIA Flying Comando en Afganistán, todavía envuelto en misterio & # 8230

El principal brote de contagio y muertes en Irán sería en Qom, el lugar de la mezquita principal donde los chiítas izaron la bandera roja de venganza por la muerte de Soleimani, donde es la central más importante, según destaca Gospa News en un informe anterior. enriquecimiento de uranio nuclear que reanudó su funcionamiento a plena capacidad tras la salida de Washington del acuerdo del Plan de Acción Integral Conjunto, acrónimo JCPOA, y más aún tras el asesinato del alto oficial del Pasdaran (otro nombre del CGRI de la Guardia Revolucionaria). Un búnker subterráneo que no se puede atacar con misiles pero no con un virus & # 8230

ARMA BIOGENÉTICA & # 8217S ALTO RIESGO PARA LA HUMANIDAD

Dada la enormidad del contagio, para un organismo de información independiente, ahora no solo es legal sino también un deber informar todas las fuentes que describen al SARS-CoV-2 como un arma biológica.

Estas curiosas coincidencias sobre su extensión geográfica en China, rival de EEUU a nivel comercial por la batalla arancelaria, superada por un acuerdo unos días antes del estallido de la epidemia, e Irán, antagonista en el frente militar y energético. , se han informado para justificar la validez creíble de la afirmación de una fuente con importantes relaciones con Rusia y contactos con la inteligencia de varios países extranjeros que obviamente nos ocupamos de mantener en el anonimato.

CoronaVirus es un arma biológica propagada por un agente de la CIA en China con nano-drones. Estados Unidos ya tiene la vacuna », nos dijo un sujeto internacional. Palabras inquietantes que deben tomarse con cautela al menos tanto como los comunicados de prensa oficiales de los países de la OTAN acostumbrados desde hace años a declarar mentiras por el supuesto bien de Occidente.

Pocas palabras para una gran pandemia que toma cada día más los contornos de un criminal ataque militar día a día y que confirma la alarma lanzada hace unos meses por el Reino Unido resaltada en el anterior informe de Gospa News sobre la sospecha & # 8211 ahora casi segura & # 8211 que la epidemia fue causada por un arma biogenética.

El Centro para el Estudio del Riesgo Existencial (CSER) de la Universidad de Cambridge en un informe de agosto destacó los peligros de la tecnología en el campo de la guerra porque «se podría construir un arma biológica para atacar a un grupo étnico específico en función de su perfil genómico». Definir esta eventualidad como «extremadamente dañina y potencialmente imparable.

EXPERTOS AMERICANOS: COVID-19 ES UNA BIOARMA

En el mismo reportaje anterior, también informamos sobre el primer experto mundial que dijo que creía que CoronaVirus era un arma biológica.

Francis Boyle es profesor de derecho internacional en la Facultad de Derecho de la Universidad de Illinois. Redactó la legislación nacional de los Estados Unidos para implementar la Convención de Armas Biológicas, conocida como Ley de Armas de Combate al Terrorismo de 1989, que fue aprobada por unanimidad por ambas cámaras del Congreso estadounidense y promulgada por el presidente George W. Bush. En una entrevista con el sitio web estadounidense Geopolitics and Empire, dijo que este instrumento de guerra se salió de control en el laboratorio de nivel 4 de bioseguridad (BSL-4) de Wuhan.

Para creer en la teoría de las armas biológicas está Jeff Brown, experto en China, fundador con otros periodistas y autores internacionales de la Comisión de la Verdad de las armas biológicas (www.bioweapontruth.com), una organización independiente que ha creado el mayor archivo de documentación, películas y publicaciones de audio sobre los Estados Unidos y Occidente. De hecho, Brown comenzó a estudiar el fenómeno desde los ataques con armas biológicas de Estados Unidos a China durante la Guerra de Corea (1950-1953) y a Japón & # 8217s infame & # 8220Unit 731 & # 8221.

Su historia está bien presentada en un artículo del periódico británico The Guardian:

Formada a mediados de la década de 1930 en Harbin, noreste de China, la Unidad 731 llevó a cabo experimentos letales en unos 3.000 prisioneros, en su mayoría chinos y coreanos. Según relatos históricos, los presos y las presas, llamados "troncos" por sus torturadores, fueron sometidos a vivisección sin anestesia después de haber sido infectados deliberadamente con enfermedades como el tifus y el cólera. A algunos les amputaron miembros o les extrajeron órganos.

«Mientras Japón se encaminaba hacia la derrota en el verano de 1945, el líder de la unidad, el teniente general Shiro Ishii, prohibió a los investigadores discutir su trabajo y ordenó la demolición de la sede de la unidad en Harbin. Al final de la guerra, las autoridades estadounidenses otorgaron en secreto a los funcionarios de la unidad inmunidad de enjuiciamiento a cambio del acceso a su investigación. Varios ex funcionarios de la Unidad 731 pasaron a tener carreras exitosas en medicina, academia y negocios », se lee en el post.

Es por eso que Brown, autor del sitio web China Rising, él mismo hoy, en una entrevista con Kevin Barrett, experto en terrorismo internacional y presentador de la transmisión de radio Truth Jihad Radio, acusa a Estados Unidos de ser los manipuladores de la epidemia: «Yo» Estoy en contacto con la gente todos los días en China. Y están en pie de guerra. Están movilizando a cientos de millones de personas. Han movilizado al ejército.

Han puesto en cuarentena como 50 millones de personas y cientos de millones de personas ahora durante las próximas dos semanas trabajarán fuera de sus hogares. Quiero decir, es por eso que la tasa de mortalidad es tan baja y el número de incidentes es relativamente bajo, aunque, como usted dice, Estados Unidos tiene el motivo. Tienen el modus operandi y los medios para hacerlo.

La entrevista, publicada en su totalidad en el sitio web Veterans Today, dirigida por veteranos oficiales de la Infantería de Marina de Vietnam y expertos en inteligencia militar y ex agentes de la CIA, fue publicada hace unos días antes de que llegara la noticia de los 6 muertos en Irán. Este hecho, sin embargo, no contradice el razonamiento de Brown, sino que simplemente lo extiende a otro grupo étnico, el islámico de Teherán.

Mapa de los biolaboratorios del Pentágono y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA) n. ° 8217 en el proyecto presentado por la periodista Dilyana Gaytandzhieva

La existencia de estudios de bioingeniería genética específicos probados en insectos y murciélagos (entre los primeros sospechosos como animal portador de la infección) reveló la misma Darpa (Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa), la agencia de investigación de armas del Pentágono que abrió oficialmente el sector biológico en 2014.

Para confirmar que en al menos 25 laboratorios controlados por el Departamento de Defensa de EE. UU. Hubo experimentos en el desarrollo de armas bioquímicas con interacciones entre virus e insectos, fue la periodista búlgara Dilyana Gaytandzhieva en su investigación sobre las actividades de otra entidad del Pentágono aún más específica: Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA).

Según lo publicado por Gospa News, el reportero, el primero en el mundo en descubrir las armas convencionales entregadas por la CIA a los terroristas de ISIS antes de que el expediente turco SETA revelara todas las formaciones yihadistas abastecidas con misiles TOW por la agencia de contrainteligencia estadounidense, descubrió la existencia de investigación en el campo de la biogenética en referencia a los genomas chino y ruso.

PROTEÍNA & # 8220 MODELADA & # 8221 PARA VOLVER A SER AGRESIVO

Bueno, las sospechas de manipulación biogenética de Gaytandzhieva, miembro de la Comisión de la Verdad de armas biológicas de Brown & # 8217 mencionada anteriormente, ahora se confirman parcialmente en una investigación científica revelada por un video de algunos exponentes del Partido Comunista Chino (CPP) que el dual chino-inglés sitio de idiomas GNews (cercano al experto en comunicación Stephen Bannon, ex coordinador de la campaña electoral ganadora de Donald Trump & # 8217) traducido del idioma original.

«El 21 de enero, tres investigadores de la Academia de Ciencias de China publicaron un artículo conjunto en la revista" Science China Life Sciences ", escrito en inglés. Revelaron la verdad sobre el nuevo coronavirus, así que por favor, mire esta noticia de cerca », se lee.

Tres investigadores encontraron esta información: Pei Hao, investigador del Instituto Pasteur de Shanghai y la Academia de Ciencias de China, Wu Zhong, investigador del Centro Nacional de Investigación en Ingeniería para Drogas Emergentes, Academia de Ciencias Médicas Militares y Xuan Li. , investigador del Laboratorio Clave de Biología Sintética, Centro CAS de Excelencia en Ciencias Moleculares de Plantas.

Los investigadores se sorprendieron cuando compararon la proteína S del SARS con la proteína S de Wuhan CoV y encontraron que no altera la composición estructural del virus a pesar de que se reemplazaron cuatro aminoácidos.

Esta investigación apunta a un descubrimiento importante de que la proteína S CoV de Wuhan apoya una fuerte interacción con las moléculas ACE2 humanas, lo que puede llevar a infectar las células epiteliales del tracto respiratorio superior. Este descubrimiento también nos dijo que Wuhan CoV es altamente contagioso por diseño. Esta investigación ha sentado una base teórica para que China desarrolle el control, la prueba y la intervención de Wuhan CoV de manera científica. Después de leer el informe de investigación, la gente está indignada por la incredulidad. El punto clave de todos estos hallazgos es que “cuatro de las proteínas S importantes han sido reemplazadas en el coronavirus de Wuhan”.

Primero, el propósito es disfrazar Wuhan CoV como SARS para que sea más difícil para los investigadores médicos y los médicos diferenciarlo del SARS. Esto los induce a tomar medidas de prevención similares al SARS, lo que puede provocar el retraso del tratamiento y una mayor propagación del virus. En segundo lugar, es tan contagioso que se propaga rápidamente por diseño; además, se culpó al Partido Comunista Chino & # 8211 ¿Puede este tipo de crimen a través de la biotecnología contra la humanidad ser cometido por murciélagos o ratas de bambú? ¡Diez mil años de evolución no pueden producir este tipo de alteración precisa de cuatro importantes proteínas S! El hecho de que el virus de Wuhan se haya creado en un laboratorio bajo la influencia humana es indiscutible. Esto es inhumano hasta el extremo ».

En 2010, China ganó la batalla contra el virus del SARS. En 2015, el hospital del EPL ganó batallas contra el virus del Ébola en África. Esta vez, nuestro enemigo eligió el Año Nuevo chino para un nuevo brote viral. Nos enfrentamos a un nuevo desafío. Todo el personal de investigación médica y prevención de epidemias de nuestro país ha entrado en un estado de preparación para la guerra. Todas las personas del país están en alerta máxima y preparadas para el combate. El pueblo chino ganará esta guerra, agregó el PCCh.

Los investigadores en el documento sintético llamado & # 8221 Evolución del nuevo coronavirus del brote en curso de Wuhan y modelado de su proteína de pico para el riesgo de transmisión humana & # 8221 publicado en la revista científica como & # 8220letter para el editor & # 8221 son más cautelosos pero resalte las mismas preocupaciones.

El artículo científico sobre Science China & # 8211 haga clic para leer el documento en inglés

De acuerdo con la estructura cristalina del dominio RBD de la proteína S del SARS-CoV complejado con su receptor ACE2 (código PDB: 2AJF), ​​la estructura del complejo 3-D de la unión de la proteína CoV S de Wuhan a la ACE2 humana se modeló con superposición estructural y rigidez molecular acoplamiento - escribieron los médicos bioquímicos & # 8211 Entonces, para nuestra sorpresa, a pesar de reemplazar cuatro de los cinco importantes residuos de aminoácidos de la interfaz, se descubrió que la proteína S CoV de Wuhan tiene una afinidad de unión significativa con la ACE2 humana. Mirando más de cerca, los residuos de reemplazo en las posiciones 442, 472, 479 y 487 en la proteína S de Wuhan CoV no alteraron la conformación estructural.

En resumen, nuestro análisis mostró que el CoV de Wuhan compartía con los coronavirus similares al SARS / SARS un ancestro común que se asemeja al coronavirus de murciélago HKU9-1. Nuestro trabajo apunta al importante descubrimiento de que el dominio RBD de la proteína S CoV de Wuhan soporta una fuerte interacción con las moléculas ACE2 humanas a pesar de su diversidad de secuencia con la proteína S del SARS-CoV. Por lo tanto, el CoV de Wuhan representa un riesgo significativo para la salud pública para la transmisión humana a través de la vía de unión Sprotein-ACE2.

VACUNA "CINCO OJOS" DE REPENTE LISTA & # 8230

Investigadores estadounidenses intentan desmontar la hipótesis de un virus de laboratorio en la discusión con varios perfiles en el sitio especializado Virologica.org donde el debate se centra en el genoma y su origen animal (el perfil genético se acerca al 99% al de un virus). cultivado en el pangolín de Malasia). Uno de estos científicos, al final de su digresión en la que excluye categóricamente la manipulación humana con argumentos bioquímicos extravagantes, agradece a Wellcome Trust por la contribución.

Esto muestra una relación evidente con uno de los principales financistas de los experimentos sobre la familia CoronaVirus antes de la epidemia. Como se informó en el artículo anterior, de hecho, esta fundación nació después de la transformación del holding farmacéutico estadounidense Wellcome absorbido por el grupo Glaxo SmithKline, el notorio GSK, líder en la producción de vacunas en el mundo pero también repetidamente investigado y condenado. de innumerables infracciones penales en materia de corrupción y leyes de salud, ya formalmente acusado de contribuir a la búsqueda de una vacuna junto con la Universidad Australiana de Queensland (ver artículo anterior).

Según las últimas noticias, en un tiempo récord, la vacuna australiana ya habría superado las primeras pruebas y ya habría comenzado su experimentación en animales cobayas.No hay que olvidar que la inteligencia de Australia SIS forma parte del grupo internacional de servicios secretos de los llamados & # 8220Five Eyes & # 8221 junto con EE.UU., Reino Unido, Canadá y Nueva Zelanda.

Por lo tanto, la patente de una nueva vacuna por parte de los australianos con la ayuda de la gran farmacéutica británica GSK, que es socia de la agencia Darpa del Pentágono en múltiples proyectos, es sin duda otro motivo de sospecha & # 8230

Wellcome Trust se encuentra en cambio entre los financiadores del Instituto Pirbright depositario de la patente núm. 10130701 en los EE. UU. Para una investigación de ConoraVirus en pollos aviares. El nombre de este centro de investigación británico se menciona en el contexto de la conversación radial entre los periodistas estadounidenses Kevin Barrett y Jeff Brown.

«Bueno, ya sabes, creo que la gente debe entender que el virus del Ébola es propiedad de, y está patentado, por el ejército de los Estados Unidos. El virus Zika está patentado por la Fundación Rockefeller. Me acabo de enterar de que el coronavirus, nuestro amigo favorito estas últimas cuatro semanas, está patentado por el Instituto Pirbright, que está financiado por Bill Gates ».

El Instituto Pirbright, obviamente, ha negado inmediatamente cualquier implicación con el tipo & # 8220humano & # 8221 del virus al reiterar que los estudios se realizaron solo en pollos. Pero también está claro que si realmente hubiera ampliado el campo de investigación se cuidaría de no declararlo en estos días de emergencia mundial.

DAÑOS GRAVES EN CHINA INCLUSO POR INFLUENCIA PORCINA

El propio Brown confirma que había recibido información sobre una proyección estimada de 65 millones de muertes en todo el mundo por parte de un informante de inteligencia que se presentó con el curioso apodo de Uriah Reep.

«Uriah Heep y yo hablamos sobre cómo obviamente fueron atacados con un virus de la gripe porcina, la gripe porcina africana, que saltó desde el área de Georgia, con el laboratorio de armas biológicas Richard Lugar directamente a China. Y luego saltó por todo el país, acabó con el 40 por ciento del porquerizo del país, en la industria porcina más grande del mundo. Y luego también hicieron lo mismo con la gripe aviar. Cuando rastrea la forma en que estos dos virus, ya sabe, se propagan por China como la pólvora. Quiero decir, al igual que en un tren de alta velocidad, no hay forma de que eso haya sucedido de forma natural, a través del movimiento normal de ganado y aves de corral ».

De hecho, debido a la gravedad de la pandemia humana, la epidemia porcina ha pasado completamente a un segundo plano. Esto ejerce presión sobre el sistema financiero chino debido a la inflación inducida por el aumento de los precios de la carne de cerdo. Los medios de GNews destacan una circunstancia muy sospechosa: la gripe porcina africana de China provino de cerdos rusos importados cuando China intentó dejar de comprar productos estadounidenses para perjudicar a los granjeros estadounidenses.

El 1 de febrero de 2020, el sitio web militar chino más influyente www.xilu.com publicó un artículo para reconocer que el coronavirus de Wuhan es artificial acusando a los EE. UU. De crear tal arma biológica contra China », informó Gnews que luego citó en su totalidad algunas frases tomadas del Portal chino.

Es posible que nuestros enemigos quieran destruir nuestra productividad. Es la llamada guerra sin restricciones que afecta a todos los aspectos de nuestra economía. La CIA puede infiltrarse en China a través de una guerra de propaganda y provocar una "revolución de color" en Hong Kong, ¿por qué no puede iniciar un ataque bioquímico en China mediante la manipulación?

Desde su nacimiento en julio de 2018, Gospa News ha elaborado múltiples reportajes investigativos sobre el intento de golpe de Estado en Venezuela, cuando en 2019 el país fue puesto de rodillas por continuos apagones provocados por sabotajes electromagnéticos que dejaron a EE. UU. Que, además de destruir diversos poderes. plantas, mató a varias personas en los hospitales que quedaron sin luz.

Escribimos sobre la guerra civil en Ucrania causada por la revolución naranja que culminó con la masacre en Kiev & # 8217s Maidan square causada por francotiradores mercenarios georgianos, sobre el conflicto en Siria, donde los Cascos Blancos financiados por Londres y Washington fueron acusados ​​de delitos graves. incluido el de los niños asesinados con cloro en Douma para organizar un falso ataque químico por parte del ejército de Damasco, y los ataques con aviones no tripulados estadounidenses contra los separatistas hutíes en Yemen que causaron miles de víctimas civiles.

Por lo tanto, en este momento, me es más fácil creer las acusaciones de los comunistas de Beijing que los silencios de la OTAN o las negaciones que provienen de la Casa Blanca.

El SARS-CoV-2 tiene todas las características para ser considerado un arma biogenética diseñada específicamente para atacar a algunos grupos étnicos, ciertamente los chinos pero probablemente también los musulmanes iraníes a la luz de las últimas muertes, y se ha manifestado como una tormenta viral perfecta: Justo en el período del Año Nuevo chino cuando los asiáticos dispersos por todo el mundo regresan a casa para celebrar con sus familiares, y unas semanas antes de las consultas electorales para la renovación del Parlamento de Teherán (este fin de semana), otro momento de grandes movimientos y contactos entre la población. Lo que ha sucedido en otros lugares puede ser el llamado & # 8220 daño colateral & # 8221 de cualquier misión militar.

Según nuestra fuente cercana a la inteligencia extranjera, el virus fue propagado en China (y probablemente en otros lugares) por agentes de la CIA equipados con & # 8220nano-drones & # 8221 que son fáciles de esconder durante el transporte y para ser utilizados sin prestar atención al transporte. de material de contagio en cápsulas o vitro para ser esparcido o detonado con descargas electromagnéticas en el momento oportuno.

La tecnología desarrollada por la agencia DARPA del Pentágono y puesta al servicio del Ejército de los EE. UU. O del Servicio Clandestino Nacional, la oficina de operaciones asesinas de la CIA y # 8217, se encuentra entre las más sofisticadas del mundo, como se informó en el informe anterior sobre armas bioquímicas. . Entre los posibles medios disponibles para el ejército estadounidense para la propagación de armas masivas se encuentran dos nuevas joyas de microingeniería.

La primera va más allá de cualquier imaginación humana para quien no está en el sector y parte de un proyecto rudimentario.

CYBER-DRAGONFLY Y EL NANO-DRONE

La CIA creó su propio dron de tamaño nanométrico en la década de 1970. En un momento en que el gobierno requería un dispositivo de escucha en miniatura, inventaron un abejorro mecánico. Su diseño inicial era demasiado difícil de controlar, por lo que abandonaron la idea e inventaron el Insectothopter, un mini drone libélula que se lee en el sitio web de Globaldroneuav, una empresa china especializada en el suministro de repuestos para vehículos aéreos no tripulados y administrada por el ejército retirado de Beijing. el coronel Qin Ren-ping, como director ejecutivo.

El insectothopter experimentó problemas con el control de vuelo siempre que los vientos cruzados eran evidentes, por lo que no se usó en el campo y ahora está guardado en el Museo de la CIA.

libélula, el ciber-insecto-espía genéticamente modificado, pilotado con luz

Según Popular Mechanics, DragonflEye es una libélula genéticamente modificada con "neuronas de dirección" sensibles a la luz implantadas en su médula espinal. Los insectos equipados con una mochila personalizada llena de sensores se pueden controlar, pero aún está en desarrollo. Los destellos de luz se utilizan para hacer que los insectos vuelen o se muevan »se lee en el mismo sitio web.

Ahora parece que el proyecto superó el primer obstáculo después de que algunas de las libélulas modificadas genéticamente hicieran su primer vuelo. La idea fue desarrollada por investigadores del Laboratorio Charles Drak Stark y el Instituto Médico Howard Hughes HHMI, que se especializa en investigación biomédica y socios en varios proyectos de DARPA. En el verano de 2017, sus primeras pruebas positivas tuvieron gran visibilidad en los medios y en YouTube también con la entrevista a los investigadores.

Este sistema supera los límites de la recolección de energía, la detección de movimiento, los algoritmos, la miniaturización y la optogenética, todo en un sistema lo suficientemente pequeño como para que un insecto lo use J. Wheeler, ingeniero biomédico del Instituto Médico Draper and Howard Hughes e investigador principal de la tecnología, dijo. en un comunicado de prensa, según Us TomoNews.

Las libélulas cyborg podrían convertirse en pequeños sistemas de vigilancia. Otras aplicaciones de esta tecnología pueden incluir polinización guiada, entrega de carga útil y se especifica la medicina y el diagnóstico de precisión.

Desde hace dos años no se sabe nada sobre DragonflEye y su posible uso en el campo militar dada la colaboración consolidada entre el Instituto Hughes y el Pentágono. Sin embargo, está claro que si una libélula puede modificarse genéticamente y controlarse remotamente para la polinización de la misma manera, se puede probar fácilmente para la propagación de un virus.

Si esta parece ser la solución más futurista con todas sus implicaciones, obviamente en detrimento del pobre insecto completamente distorsionado por un sufrimiento que nadie conocerá jamás, existe una alternativa mucho menos de ciencia ficción y más pragmática ya ampliamente utilizada por diversos organismos de la OTAN. ejércitos. Es el nano-UAV Black Hornet producido por el Norwegian Prox Dynamics y ya despiadado por las Fuerzas Armadas Británicas en Afganistán desde 2012 como un dron de vigilancia y reconocimiento.

Adoptado también por la Infantería de Marina de los EE. UU., El Ejército Australiano y los departamentos especiales de la Bundeswehr del ejército alemán y el Forsvaret noruego, es el dispositivo volador por control remoto más pequeño que existe, ya que mide solo 10 cm de longitud con un diámetro de rotor de 12 cm.

Nano-drone Black Hornet 3 que puede volar incluso en áreas sin GPS

La empresa escandinava fue luego adquirida por la corporación estadounidense FLIR Systems, Inc., líder en el diseño y producción de cámaras infrarrojas y uno de los principales proveedores del Departamento de Defensa de Estados Unidos. En junio de 2018, se presentó la versión actualizada de Black Hornet 3 que al sistema de reconocimiento personal (PRS) del nano-drone original agregó la posibilidad de navegar en entornos sin GPS, permitiendo al caza mantener la conciencia situacional, detección de amenazas y vigilancia. donde sea que le lleve la misión.

Tener la capacidad de volar sin una conexión GPS puede, por lo tanto, escapar a la detección del radar en vista de su tamaño microscópico. Está en los dedos de la mano de un soldado, tiene un peso en vacío de 18 g, una velocidad de crucero de 36 km / h, una autonomía de 25 minutos (pero en caso de problemas o batería insuficiente vuelve a la base de forma autónoma ) y un alcance de 1.600 metros. Se pilota a través de un monitor conectado a la cámara instalada en la aeronave. El kit de control con dos dispositivos pesa menos de 1 kg y cabe en la mochila de un militar como en la de cualquier turista que visite China ...

Por tanto, con estas referencias hemos demostrado cómo la difusión de un arma biológica a través de nano-drones suministrados por fuentes de inteligencia internacionales es perfectamente concebible y practicable. Quién podría haberlo implementado, cómo, dónde y cuándo, obviamente, quedan misterios.

& # 8220Dark Prince & # 8221 era ciertamente consciente de estos misterios, Michael d & # 8217Andrea, comandante de las operaciones especiales de la Agencia Central de Inteligencia & # 8217 en el Medio Oriente, que desapareció en el Bombardier / Northrop Grumman E-11 Un avión espía se estrelló & # 8211 o derribado & # 8211 en Afganistán unos días. antes de que el virus se convirtiera en una tremenda epidemia en China y en muchos países del mundo. Los jefes estadounidenses 007 desaparecieron repentinamente junto con todos sus secretos & # 8230

© 2020 & # 8211 Fabio Giuseppe Carlo Carisio & # 8211 no reproducción sin autorización & # 8211 versione originale in italiano


Partiendo de la nada

Cuando las autoridades sanitarias chinas se enfrentaron por primera vez al brote, tenían una familiaridad inquietante. Ya habían lidiado con un conjunto similar de síntomas durante el brote de SARS a principios de la década de 2000 y habían visto la propagación del MERS una década después. Gracias a estos virus y otros relacionados, ya teníamos una descripción detallada de la estructura del genoma típico del coronavirus ya en 2005. Sin duda, ese conocimiento resultaría esencial para el primer paso en el desarrollo de una prueba de diagnóstico rápido: la caracterización del genoma del nuevo virus. virus, 2019-nCoV.

Debido a que sabemos cómo es el coronavirus promedio, hemos podido identificar áreas que no cambian mucho con la evolución de nuevos miembros de esta familia de virus. Y eso nos permite obtener secuencias de su genoma sin antes aislar el virus.

El primer desafío de secuenciar el genoma de un coronavirus es que está hecho de ARN en lugar de ADN. La mayoría de nuestras herramientas para trabajar con ácidos nucleicos son específicas del ADN. Afortunadamente, hemos descubierto una enzima llamada "transcriptasa inversa" que toma ARN y hace una copia del ADN; la transcripción es la copia de ADN en ARN, esta enzima hace lo contrario, de ahí el nombre. (La transcriptasa inversa se identificó por primera vez en otros virus de ARN que deben copiarse en el ADN como parte de la infección). Con la transcriptasa inversa, los investigadores pudieron hacer copias de ADN de partes de 2019-nCoV como primer paso para estudiar su genoma.

Pero la transcripción inversa de muestras de individuos infectados simplemente crearía un lío de fragmentos de ADN de todo lo presente: las propias células del paciente, bacterias inofensivas, etc. Afortunadamente, las técnicas de secuenciación y análisis de ADN se han vuelto tan avanzadas que ahora es posible secuenciar todo el lío, cosas irrelevantes y todo, y dejar que las computadoras solucionen lo que está presente. El software puede tomar lo que sabemos sobre el genoma promedio del coronavirus e identificar todos los fragmentos de secuencia que Mira como si vinieran de un coronavirus. Otro software puede determinar cómo se superponen todos estos fragmentos y luego unirlos, produciendo un genoma de coronavirus casi completo.

En este punto, las autoridades sanitarias chinas reconocieron que el virus implicado en estas infecciones era nuevo y rápidamente publicaron la secuencia del genoma del virus para que otras organizaciones sanitarias pudieran estar preparadas.


Luces láser y LED - Tratamientos GHK-Cu

Miller TR, Wagner JD, Baack BR, Eisbach KJ, Efectos del complejo de tripéptido de cobre tópico en la piel rejuvenecida con láser de CO2. Arch Facial Plast Surg. 2006 julio-agosto 8 (4): 252-9.

Cangul IT, Gul NY, Topal A, Yilmaz R, Evaluación de los efectos del complejo tópico de tripéptido-cobre y óxido de zinc en la cicatrización de heridas abiertas en conejos. Vet Dermatol. 17 de diciembre de 2006 (6): 417-23.

Huang PJ, Huang YC, Su MF, Yang TY, Huang JR, Jiang CP, Observaciones in vitro sobre la influencia de las ayudas peptídicas de cobre para la fotoirradiación con LED de la síntesis de colágeno de fibroblastos. Cirugía láser Photomed. 25 de junio de 2007 (3): 183-90.

Estimulación del crecimiento del cabello

Publicaciones sobre SRCP y crecimiento del cabello

Se describen métodos para el diseño y ensayo de complejos péptido-cobre con propiedades para el crecimiento del cabello.

Se describió una amplia variedad de análogos de GHK-Cu que aumentan el tamaño del folículo piloso y aumentan el crecimiento del cabello en ratones y ratas.

Estudio Resultado Referencia
Uso de análogos de GHK-Cu para el agrandamiento de los folículos pilosos y la estimulación del crecimiento del cabello. Patente de Estados Unidos 5.120.831 Nuevos complejos y derivados de péptidos metálicos utilizados para estimular el crecimiento del cabello en animales de sangre caliente, especialmente humanos. Pickart Patente de EE.UU. 5.177.061 Composiciones para estimular el crecimiento del cabello que contienen complejos cúpricos de derivados peptídicos que incluyen. éster n-octílico de glicil-1-histidil-1-lisina. Pickart Patente de los Estados Unidos 5.214.032 Nuevos compuestos de cobre de glicil-histidil-lisilo utilizados para estimular el crecimiento del cabello. Pickart US 5.550.183 Composiciones de péptidos metálicos y métodos para estimular el crecimiento del cabello. Pickart
Estimulación del crecimiento del cabello en ratones. Se probaron los análogos de GHK con residuos hidrófobos y se encontró que estimulan el crecimiento del pelo en ratas. Las propiedades estimulantes del folículo piloso de los complejos peptídicos de cobre. Resultados en ratones C3H. Fors, Pickart y Uno Ann N Y Acad Sci 1991 26642: 468-9
Estimulación del crecimiento del cabello en ratones y ratas. Los detalles de la estimulación del cabello por péptidos de cobre se estudiaron mediante 1) fototricograma, 2) foliculograma (análisis micro morfométrico) y 3) la tasa de síntesis de ADN en las células foliculares. Los efectos fueron esencialmente una estimulación de la proliferación de células foliculares, lo que resultó en un agrandamiento de los folículos anágenos desde el vello al tipo terminal (terapia) o un mantenimiento de los folículos terminales piojosos (prevención). Un SRCP (PC1020) tuvo el efecto de agrandamiento folicular en la piel de la espalda de ratas peludas, cubriendo los folículos vellosos. Los agentes químicos y los péptidos afectan el crecimiento del cabello. Uno y Kurata (Universidad de Wisconsin, Madison, EE. UU.) J Invest Dermatol 1993 101 (1 Suppl): 143S-147S
Minimizar la caída del cabello después de la quimioterapia contra el cáncer Protección de la caída del cabello mediante el complejo péptido-cobre en modelos animales de alopecia inducida por quimioterapia. Revista de ciencia dermatológica Awa y Nogimori, Vol: 10, 1995, 99-104
Crecimiento del cabello humano Estimulación del crecimiento del cabello en humanos con análogos de GHK-Cu Análisis de fototricograma de la estimulación del folículo piloso: un estudio clínico piloto con un complejo de péptido-cobre. Patt, Duncan y Kalis (Universidad de Reims, Francia) Técnicas de investigación dermatológica, (CRC Press), pp-217-226, 1996
Crecimiento de pelo en ratas Estimulación del crecimiento del cabello en ratas. Evaluación cuantitativa de la estimulación del folículo piloso inducida por el complejo péptido-cobre mediante el uso de Fuzzy Rat, Uno, Packard, Patt (Universidad de Wisconsin) Técnicas de investigación dermatológica, (CRC Press), pp-227-239, 1996
Crecimiento de pelo en ratas Estimulación del crecimiento del pelo en ratas con análogos de GHK-Cu Evaluación de la estimulación telógena del folículo piloso utilizando un modelo in vivo: resultados con complejos péptidos de cobre. Timpe, Dumwiddie, Patt (Procyte Corp.) Técnicas de investigación dermatológica, (CRC Press), págs-241-254, 1996
Estudio humano del crecimiento del cabello con análogo GHK-Cu Se comparó el análogo de GHK-CU en Tricomin con 2% de minoxidil. Tricomin 2.5% aumentó el recuento de cabello en 97 cabellos no vellosos, mientras que el 2% de minoxidil aumentó el recuento de 73 cabellos no vellosos después de 3 meses (recuento de cabello no velloso) Comunicado de prensa de Procyte Corp. 1997
Péptidos de cobre de acción prolongada resistentes a la degradación utilizados para estimular el crecimiento del cabello Cobre probado complejado con peptonas proteicas para los efectos del crecimiento del cabello en ratones. La mezcla de cobre y péptido produjo más crecimiento de pelo en ratones que los análogos de GHK-Cu Pickart Patente de EE.UU. 5.554.375 Composiciones regeneradoras y protectoras de tejidos.
Revisar Remodelación de la piel y crecimiento del cabello. Pickart L, Efecto de los péptidos de cobre sobre el crecimiento y la condición del cabello, Dermatología del lenguaje corporal 2004, Número 7, páginas 20-22
Revisar Remodelación de la piel y crecimiento del cabello. Pickart L, péptidos de cobre remodeladores de la piel para mejorar el crecimiento del cabello, cosméticos y medicina (Rusia) 2004, número 3, páginas 14-29
Estudio de folículos humanos en cultivo de órganos AHK-Cu aumentó el crecimiento de las células foliculares al tiempo que disminuyó la muerte celular programada (apoptosis) Pyo HK, Yoo HG, Won CH, Lee SH, Kang YJ, Eun HC, Cho KH, Kim KH, El efecto del complejo tripéptido-cobre en el crecimiento del cabello humano, Arch Pharm Res 2007, vol 7, 834-839.

Análogos de GHK-Cu y estimulación del crecimiento del cabello

Ciertos análogos de GHK-Cu tienen la propiedad de agrandar los folículos pilosos y estimular el crecimiento del cabello. Estos análogos tienen un carácter más parecido a la grasa que GHK-Cu.Este aumento en las propiedades similares a las grasas se obtiene sintetizando químicamente ácidos grasos en la molécula de GHK o uniendo residuos de aminoácidos como alanina, fenilalanina o leucina a la estructura básica de GHK.

Estos análogos surgieron originalmente en un intento de crear análogos de GHK-Cu que serían retenidos en los tejidos corporales durante períodos de tiempo más prolongados. Sin embargo, se observó que, si bien tales análogos eran agentes de cicatrización de heridas superiores, también aumentaban notablemente el crecimiento del cabello alrededor de la periferia de las heridas experimentales en ratones.

Estos análogos estimulantes del cabello fueron creados por los Dres. Steven Lovejoy, Loren Pickart y Boris Weinstein. Los efectos de reparación de la piel y mejora del crecimiento del cabello están estrechamente relacionados. La piel nueva parece surgir del folículo piloso. Ciertos productos a base de Iamin se pueden usar tanto para reparar la piel como para aumentar el tamaño de los folículos pilosos y estimular el crecimiento del cabello. A medida que una persona envejece, nuestros folículos pilosos se vuelven más pequeños, produciendo tallos de cabello más delgados. Una de las principales causas de la miniaturización de los folículos pilosos parece deberse al desarrollo de cambios notables en los capilares que rodean los folículos pilosos. Los estudios exhaustivos del cuero cabelludo masculino desde el nacimiento hasta la senescencia encuentran cambios muy significativos en la estructura de los vasos sanguíneos del cuero cabelludo. El número de asas de capilares sanguíneos que irrigan el folículo piloso disminuye considerablemente. La circulación subepidérmica inadecuada que puede desarrollarse a medida que los hombres envejecen no proporciona una nutrición rica para el folículo. El crecimiento fuerte del cabello requiere un gran flujo de nutrientes como vitaminas, minerales y aminoácidos para que el folículo pueda sintetizar activamente cabello nuevo.

Las alteraciones del flujo sanguíneo al folículo y su reversión pueden explicar por qué la administración de péptidos de cobre (como Tricomin) en el cuero cabelludo aumenta el crecimiento del cabello y aumenta el tamaño de los tallos del cabello. Se sabe desde hace mucho tiempo que ciertos complejos de cobre-péptido estimulan fuertemente la angiogénesis o la formación de nuevos vasos sanguíneos. El aumento en el tamaño del folículo piloso y la tasa de crecimiento del cabello causado por la administración de péptidos de cobre puede deberse a que provocan cambios en el flujo sanguíneo que proporcionan los nutrientes adecuados al folículo, produciendo un crecimiento más rápido del cabello con tallos de cabello más gruesos. El ión de cobre complejado con ciertos péptidos tiene efectos tanto de reparación de la piel como de mejora del crecimiento del cabello. Ejemplos de esto son Tricomin y GraftCyte, que se basan en el trabajo anterior de Pickart (de ProCyte Corporation).

Más crecimiento de células foliculares y muerte celular menos programada (apoptosis)

Durante el envejecimiento en hombres y mujeres, hay una disminución progresiva del tamaño de los folículos pilosos. Esto produce un cabello más delgado y con el tiempo detiene el crecimiento de cabello nuevo.

Pyo et al (referencia anterior) proponen, basándose en estudios de folículos pilosos humanos, que las acciones de los péptidos de cobre aumentan el crecimiento celular en folículos pilosos cultivados mientras disminuyen la muerte celular programada o la apoptosis. Los péptidos de cobre también disminuyen la proteína Bax, lo que aumenta la apoptosis. Sus estudios utilizan Ala-His-Lys-cobre, como un análogo cercano de GHK, que descubrí que estimula el crecimiento del cabello hace muchos años.

Por lo tanto, los péptidos de cobre pueden funcionar reduciendo la tasa de muerte celular programada en los folículos del cabello humano que, en última instancia, detiene el crecimiento del cabello humano.

Se afeitó la piel del ratón de la izquierda y luego se trató en tres puntos con péptidos de cobre. El resultado es un crecimiento del cabello mucho más rápido (los tres parches circulares de cabello) en los tres puntos tratados con péptidos de cobre. Si bien el crecimiento del cabello humano no responderá tan dramáticamente como en los ratones, la salud de la piel y la función del folículo piloso están estrechamente relacionadas entre sí. La piel nueva parece surgir del folículo piloso. A medida que una persona envejece, nuestros folículos pilosos se vuelven más pequeños, lo que produce tallos de cabello más delgados. La circulación sanguínea que suministra nutrientes y oxígeno al folículo piloso envía menos vasos sanguíneos al folículo piloso, inhibiendo así el flujo vital de nutrientes al folículo piloso. Los complejos de cobre y péptidos mejoran la salud de la piel y una piel más sana aumenta la red de vasos sanguíneos de los folículos pilosos, lo que da como resultado folículos más grandes que hacen crecer el cabello más rápido con tallos de cabello más gruesos.



En las imágenes microscópicas de la izquierda, los aumentos son idénticos. La foto superior es piel de ratón sin tratar con péptidos de cobre. La foto de abajo es piel de ratón tratada con péptidos de cobre. Tenga en cuenta los folículos pilosos más grandes (las columnas púrpuras alargadas) en la foto inferior, el mayor contenido de grasa subcutánea en la piel (el material blanco en el centro de la piel) y el mayor grosor de la piel. Cuando somos jóvenes, tenemos una capa de grasa debajo de la piel (parte de la "grasa del bebé") que se reduce considerablemente a medida que envejecemos. Los investigadores del cabello han notado la acumulación de esta grasa alrededor de los folículos sanos que están creciendo vigorosamente, y su relativa falta alrededor de los folículos inactivos, han postulado que estas células tienen una función de apoyo para el folículo piloso. Debe enfatizarse que los efectos en humanos sobre la salud del folículo piloso no son tan dramáticos.

¿Formación de nuevos folículos pilosos?

A veces, las SRCP aparentemente pueden inducir una proliferación de folículos pilosos, aunque este fenómeno es difícil de reproducir de manera consistente. La fotografía de la parte superior es un campo microscópico de folículos pilosos de ratón en un animal tratado solo con solución salina. La fotografía de la parte inferior es un área similar de piel de ratón tratada con péptidos de cobre y que tiene una densidad mucho mayor de folículos pilosos. Los experimentos individuales sobre la multiplicación de los folículos pilosos son consistentes, es decir, el efecto es real cuando ocurre, pero los resultados repetidos son difíciles de obtener. La variabilidad puede deberse a diferentes tiempos en el ciclo de crecimiento del cabello o cambios leves en el tipo o formulación de las preparaciones de péptido de cobre. Tales experimentos sugieren fuertemente que, bajo ciertas circunstancias, se puede inducir la formación de nuevos folículos pilosos en animales adultos.

Reducir la caída del cabello después de la quimioterapia / Reducir la caída del cabello durante la quimioterapia

La pérdida de cabello causada por los medicamentos de quimioterapia utilizados para el tratamiento del cáncer se puede minimizar con péptidos de cobre. Awa y Nogimori descubrieron que la aplicación de péptidos de cobre minimiza la pérdida de cabello después de la quimioterapia y acelera el crecimiento de cabello nuevo en ratas.

Las ratas se pretrataron con SRCP y luego se expusieron a fármacos quimioterapéuticos. Esto reduce la caída del cabello.

Si las ratas recibieron primero medicamentos quimioterapéuticos y luego se trataron con SRCP, los SRCP aceleraron el crecimiento del cabello.

T. Awa, K. Nogimori y R. Trachey, Protección de la caída del cabello por complejo péptido-cobre en modelos animales de alopecia inducida por quimioterapia. J. Derm. Sci. 10, 99-104 (1995)

GHK, cobre, regeneración y células madre

La causa principal del envejecimiento es la disminución de la función de los órganos con el tiempo. Hasta los 20 años, los tejidos y órganos se mantienen en un estado completamente funcional y saludable. Pero a medida que envejecemos, la reparación se ralentiza y nuestros órganos no cumplen su función biológica. Las células madre adultas en los órganos crean nuevas células para su reparación y la proteína clave para activar y apoyar la función de las células madre parece ser la proteína P63. Sin P63 adecuado, la piel envejece rápidamente al igual que otros tejidos del cuerpo.

GHK-Copper aumenta la proteína P63 además de todas las otras funciones protectoras y reparadoras de GHK-Copper. Este es el enlace final para comprender el papel del GHK-Cobre en el cuerpo humano, como se muestra en el gráfico a continuación.

Estudios recientes revelaron que los animales más viejos tienen tantas células madre adultas en sus cuerpos como los animales jóvenes. Sin embargo, estas células madre no se diferencian en los tipos de células necesarias para rejuvenecer el tejido más viejo.

Por mis estudios anteriores, sabemos la cantidad de GHK-Cobre necesaria para activar una fuerte curación sistémica de la piel en todo el cuerpo en ratones, ratas y cerdos. Esto debería ser el mismo que el necesario para aumentar la P63 y activar las células madre epiteliales, ya que la cicatrización de las heridas se produce a través de las acciones de las células madre. GHK-Copper también debe activar otros tipos de células madre adultas, ya que tiene fuertes acciones curativas en el estómago, el revestimiento intestinal y el tejido óseo. Aproximadamente, 75 miligramos de GHK-Cobre inyectados tres veces por semana deberían ser suficientes para activar las células madre humanas y mejorar la función de los órganos en las personas mayores. Es posible que GHK-Copper sea eficaz como suplemento oral encerrado en liposomas especiales que son absorbidos por el sistema linfático para evitar una posible degradación por las enzimas intestinales.

El nivel de 75 miligramos de GHK-Cobre debería ser muy seguro y está 280 veces por debajo de las acciones negativas esperadas de la molécula causadas por sus acciones reductoras de la presión arterial.

En estudios de cultivo celular, GHK-cobre aumenta la diferenciación de células madre embrionarias. Sin embargo, en un sistema de cultivo de órganos, GHK-cobre y quotactivó "células madre adultas que luego produjeron más queratinocitos.

GHK probado para detener la diferenciación de células madre

GHK-Cu probado para estimular la diferenciación de células madre

GHK redujo el potencial clonogénico de las células madre en un 78%

GHK-Cu aumentó el cobre celular en un 2162% por encima del valor de control y provocó la diferenciación de las células madre

Métodos para controlar la proliferación y diferenciación de células madre y progenitoras, Patente de los Estados Unidos: 6,962,698, Peled, Tony, Fibach, Eitan, Treves Avi, Gamida Cell Ltd. (Jerusalén, IL) y Hadasit Medical Research Services and Development, Ltd. (Jerusalén , ILLINOIS)

Células madre adultas activadas por GHK-cobre al aumentar las integrinas, P63 y PCNA. Este aumento de la proliferación de queratinocitos.

Arch Dermatol Res. 2009 Abril 301 (4): 301-6. El cobre-GHK aumenta la expresión de integrinas y la positividad de p63 por parte de los queratinocitos. Kang YA, Choi HR, Na JI, Huh CH, Kim MJ, Youn SW, Kim KH, Park KC. Departamento de Dermatología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seúl, República de Corea.

El glicil-L-histidil-L-lisilo (GHK) posee una alta afinidad por los iones cobre (II), con los que forma espontáneamente un complejo (cobre-GHK). Es bien sabido que el cobre-GHK juega un papel fisiológico en el proceso de curación de heridas y reparación de tejidos estimulando la síntesis de colágeno en fibroblastos. Este estudio se realizó para investigar los efectos del cobre-GHK en los queratinocitos. Se analizaron los efectos proliferativos y se realizaron tinciones con hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica para evaluar los efectos del cobre-GHK en modelos de piel equivalente (EE). Además, se realizó una transferencia de Western. En los queratinocitos cultivados en monocapa, el cobre-GHK aumentó la proliferación de queratinocitos. Cuando se evaluaron los modelos SE, las células basales se volvieron cuboidales cuando se añadió cobre-GHK. El análisis inmunohistoquímico reveló que el cobre-GHK aumentó el antígeno nuclear celular proliferante (PCNA) y la positividad de p63. Además, la expresión de integrina alfa6 y beta1 aumentó en modelos SE, y estos resultados fueron confirmados por Western blot. Los resultados de este estudio indican que el tratamiento con cobre-GHK puede incrementar el potencial proliferativo de los queratinocitos basales al modular la expresión de integrinas, p63 y PCNA. Además, el aumento de los niveles de p63, un posible marcador de células madre de la piel, sugiere que el cobre-GHK promueve la supervivencia de las células madre basales en la piel.

Célula madre celular. 25 de julio de 2009 (1): 64-75. TAp63 previene el envejecimiento prematuro al promover el mantenimiento de las células madre adultas. Su X, Paris M, Gi YJ, Tsai KY, Cho MS, Lin YL, Biernaskie JA, Sinha S, Prives C, Pevny LH, Miller FD, Flores ER. Departamento de Oncología Molecular y Celular, Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas, Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas, Houston, TX 77030, EE. UU.

Los mecanismos celulares que regulan el mantenimiento de las células madre tisulares adultas aún se desconocen en gran medida. Mostramos aquí que el miembro de la familia p53, TAp63, es esencial para el mantenimiento de los precursores epidérmicos y dérmicos y que, en su ausencia, estos precursores envejecen y la piel envejece prematuramente. Específicamente, hemos desarrollado un ratón knockout condicional TAp63 y lo usamos para la ablación de TAp63 en la línea germinal (TAp63 (- / -)) o en células que expresan K14 en la capa basal de la epidermis (TAp63 (fl / fl) K14cre +). Los ratones TAp63 (- / -) envejecen prematuramente y desarrollan ampollas, ulceraciones cutáneas, senescencia de las células dérmicas y epidérmicas asociadas al folículo piloso y disminución de la morfogénesis del pelo. Es probable que estos fenotipos se deban a la pérdida de TAp63 en precursores dérmicos y epidérmicos, ya que ambos tipos de células muestran proliferación defectuosa, senescencia temprana e inestabilidad genómica. Estos datos indican que TAp63 sirve para mantener las células madre de la piel adulta regulando la senescencia celular y la estabilidad genómica, previniendo así el envejecimiento prematuro de los tejidos.

La senescencia celular es una forma distintiva de detención del ciclo celular que se ha sugerido para modular los procesos de supresión tumoral y envejecimiento. Aunque está surgiendo una comprensión detallada de la maquinaria celular que regula este proceso, se necesita una comprensión más profunda de los actores clave que relacionan la senescencia con el envejecimiento del organismo. El descubrimiento reciente de que la pérdida de la proteína p63 relacionada con p53 induce la senescencia celular y causa características de envejecimiento acelerado proporciona una evidencia adicional de que la senescencia celular está íntimamente relacionada con el envejecimiento del organismo e identifica a la p63 como un regulador clave de ambos procesos.

El miembro p63 de la familia p53 comprende múltiples isoformas y es crítico para el desarrollo epitelial estratificado. En este número de Cell Stem Cell, al generar ratones knockout específicos de isoforma, Su et al. (2009) revelan roles fundamentales para TAp63 en el mantenimiento de precursores dérmicos y epidérmicos, estabilidad genómica y longevidad del organismo

La característica distintiva de las células madre adultas es su extraordinaria capacidad para dividirse antes del inicio de la senescencia. Si bien los epitelios estratificados como la piel, la próstata y la mama son altamente regenerativos y representan de manera desproporcionada los cánceres humanos, los genes esenciales para la capacidad proliferativa de sus células madre siguen siendo desconocidos. Aquí analizamos p63, un gen cuya deleción en ratones da como resultado la pérdida catastrófica de todos los epitelios estratificados. Demostramos que p63 se expresa fuertemente en células epiteliales con alta capacidad clonogénica y proliferativa y que las células madre que carecen de p63 sufren un deterioro proliferativo prematuro. Además, mostramos que p63 es prescindible tanto para el compromiso como para la diferenciación de estas células madre durante la morfogénesis tisular. Juntos, estos datos identifican a p63 como un determinante clave específico del linaje de la capacidad proliferativa en las células madre de los epitelios estratificados.

Estudios de cicatrización de heridas y reparación de la piel con SRCP

Se investigó la cicatrización de la herida quirúrgica en 10 ratas de control y 10 ratas tratadas con GHK-Cu.

La aplicación de GHK-Cu cierre de heridas marcadamente estimulado

Efecto de los medicamentos inyectados localmente sobre la cicatrización de las heridas de las almohadillas en perros. Swaim SF, Vaughn DM, Kincaid SA, Morrison NE, Murray SS, Woodhead MA, Hoffman C.E, Wright JC, Kammerman JR, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Auburn, AL, EE. UU., Am J Vet Res 1996 Vol. 57, 394-9

Evaluación de medicamentos con complejos de cobre multipeptídicos sobre la cicatrización de heridas abiertas en perros. Swaim, Bradley, Spano, McGuire y Hoffman (Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Auburn, AL, EE. UU.) J Amer Ani Hos Assoc. 29, 519-525, 1993

La curación está muy afectada en pacientes inmunodeprimidos y la contracción de la herida se ve afectada: las ratas fueron inmunodeprimidas con inyecciones de cortisona y luego se determinó el efecto de GHK-Cu.

En ratas inmunodeprimidas, la síntesis de colágeno fue el 23% de la de ratas normales. GHK-Cu triplicó con creces la síntesis de colágeno en estas ratas, elevándola al 77% de la normal y restableció la curación normal. GHK-Cu restauró la contracción normal de la herida en ratas reprimidas

Crema GHK-Cu probada para la cicatrización de úlceras cutáneas.

GHK-Cu aumento de la reepitelización de la úlcera

Curación mejorada de úlceras en pacientes con diabetes mediante el tratamiento tópico de glicil-l-histidil-l-lisina Mulder GD, Patt L, Sanders L, Rosenstock J, Altman MI, Hanley ME, Duncan GW, Wound Rep Reg 2: 259-269 , 1994

GHK-Cu probado en la cicatrización de heridas de incisión lineal.

GHK-Cu aumentó la resistencia a la tracción de la herida en un 74% y la neovascularidad en un 69%.

Se probaron SRCP de segunda generación para la reparación de la piel lesionada por alergia al níquel en humanos.

Un estudio doble ciego controlado con placebo encontró una recuperación acelerada de la piel después de una lesión y además una potente acción antiinflamatoria.

Se probaron SRCP de segunda generación en la reparación de la piel dañada con cinta adhesiva humana.

Un estudio doble ciego controlado con placebo encontró una aceleración de la tasa de reparación de la piel.

Se probaron SRCP de segunda generación en la reparación de la piel humana dañada por detergente las 24 horas.

Un estudio doble ciego controlado con placebo encontró que aceleró la tasa de reparación de la piel

SRCPs de segunda generación probados en la reparación de la piel humana dañada por acetona.

Un estudio doble ciego controlado con placebo encontró una aceleración de la tasa de reparación de la piel.

Cangul IT, Gul NY, Topal A, Yilmaz R, Evaluación de los efectos del complejo tópico de tripéptido-cobre y óxido de zinc en la cicatrización de heridas abiertas en conejos. Vet Dermatol. 17 de diciembre de 2006 (6): 417-23.

Arul V, Kartha R, Jayakumar R, Un enfoque terapéutico para la cicatrización de heridas diabéticas utilizando matrices de colágeno incorporadas con GHK biotinilado, Life Sci. 2007 Ene 280 (4): 275-84.

Fundación de ProCyte para el desarrollo de productos de cicatrización de heridas

En 1985, Barbara Weinstein y yo fundamos ProCyte Corporation para desarrollar GHK-Cu para usos clínicos en la cicatrización de heridas. William Weinstein, su hijo y abogado, obtuvieron los derechos de patente de la tecnología para la empresa. Dado que GHK-Cu tenía acciones directas sobre las células importantes en la curación, nombré a la empresa ProCyte (palabras latinas que significan) "para la célula". El Dr. John Majnarich nos brindó espacio y suministros de laboratorio.

Desde entonces, GHK-Cu ha tenido numerosos éxitos en la cicatrización experimental de heridas en modelos animales. Sin embargo, en los estudios clínicos en humanos ha tenido un número de éxitos limitados y no ha podido demostrar su eficacia en la 3ª fase en dos ensayos clínicos para la aprobación de fármacos. Sin embargo, este patrón de éxitos y fracasos es similar a otros factores de crecimiento de heridas en los ensayos clínicos. Hasta la fecha (2005), ningún factor de curación exitoso se ha establecido en el mercado.

Johnson & amp Johnson vende el agente de cicatrización de heridas de mayor éxito, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o PDGF, como Regranex. Pero solo mejora el cierre de las úlceras diabéticas en aproximadamente un 20%.

Los estudios de rango de dosis adecuados de GHK-Cu en varias formulaciones nunca se han realizado de manera adecuada. Diseñé el primer ensayo clínico piloto en Francia en 1987-1988 que utilizó una concentración del 4% de GHK-Cu en una crema con un mínimo de conservantes, ya que muchos conservantes comunes inhiben la reparación de la piel. Debido al bajo nivel de conservante, esta crema requirió refrigeración. Este estudio de 60 pacientes con úlceras por estasis diabéticas y venosas demostró una rápida curación. Esta formulación aparentemente exitosa nunca se usó en estudios clínicos posteriores, que no lograron los objetivos terapéuticos en los ensayos de la FDA para usos clínicos.


Bernard Kalis (Universite de Reims) quien, junto con sus colegas, realizó las primeras pruebas exitosas de GHK en la curación de heridas humanas.


Un siguiente estudio en 1990 diseñado por Schering Plough Pharmaceutical utilizó una crema similar pero con una adición de alcohol benzoílico al 1% como conservante adicional. En retrospectiva, la adición de alcohol benzoílico fue un error, ya que ahora se sabe que el alcohol benzoílico inhibe la función de los fibroblastos de la herida aproximadamente 100 veces más de lo que inhibe el crecimiento de bacterias. La crema GHK-Cu mejoró la cicatrización de las heridas causadas por la Cirugía de Moh. Sin embargo, no aceleró la curación de las úlceras por estasis venosa, que puede ser un modelo deficiente para probar las formulaciones de curación de heridas ya que otros factores de crecimiento como PDGF, TGF, FGF y EGF no han logrado demostrar la curación estadística de las úlceras por estasis venosa.

No obstante, después de esto, otros pequeños estudios en humanos dieron evidencia de cicatrización de heridas. Un estudio bien controlado publicado en 1993 de 120 pacientes diabéticos en un solo centro médico encontró evidencia de curación acelerada de las úlceras diabéticas. Un estudio doble ciego más grande en 1995 no pudo demostrar un mejor cierre, pero encontró que GHK-Cu mejora la reepitelización de las úlceras.

Este estudio utilizó 505 pacientes en 33 centros médicos con un promedio de 17 pacientes por centro médico. Dada la variación en los procedimientos de tratamiento en varios centros médicos, esto puede haber aumentado la variación estadística y degradado los datos. Las concentraciones de GHK-Cu utilizadas (2,0% y 0,5%) parecen demasiado bajas para una curación eficaz. Además, el alcohol benzoílico, que se sabía que inhibía los fibroblastos de las heridas, inexplicablemente todavía se usaba como conservante.

Debido a la rápida descomposición de GHK-Cu, las dosis deben estar en el rango de 4% a 10% y es mejor aplicar GHK-Cu en una crema no iónica que libera lentamente GHK-Cu en el tejido herido.

Ejemplo: curación de la dermatitis preulcerosa

Uno de los mejores usos de los SRCP sería la curación de la dermatitis preulcerosa antes de que la piel dañada desarrolle llagas abiertas. Las fotografías de la izquierda son un ejemplo de la curación de la piel "en riesgo" con dermatitis preulcerosa. En la foto superior, el paciente tiene dos úlceras cutáneas abiertas visibles en la parte superior e inferior izquierda de la foto. A la derecha de la foto, hay fisuras rojizas que se convierten en úlceras cutáneas. En la foto inferior, la aplicación de una crema de péptido de cobre en la periferia de las úlceras cutáneas ha curado la piel agrietada y ha impedido el desarrollo de ulceras ulteriores. Se debe enfatizar que esta crema de péptido de cobre en particular fue diseñada específicamente para la piel "en riesgo" en la etapa de dermatitis preulcerosa para ayudar a prevenir una mayor degradación de la piel. No fue aprobado para el tratamiento de úlceras cutáneas abiertas.


Ejemplo: curación de úlceras cutáneas diabéticas

Las personas con diabetes suelen tener una reparación cutánea lenta e inadecuada. Las complicaciones cutáneas de la diabetes provocan que la piel esté seca, que tiende a agrietarse y que cicatrice lentamente. Las úlceras en las piernas y los pies son la principal causa de amputaciones de la parte inferior de la pierna y, en la actualidad, aproximadamente el 10% de los pacientes diabéticos requieren una amputación durante su vida. La razón principal de la amputación son las infecciones asociadas con el desarrollo de piel lesionada y ulcerada. Las personas con diabetes tienen 15 veces el riesgo promedio de sufrir amputaciones de extremidades.

Las cremas SRCP a menudo producen una mejora rápida en la salud de la piel y ayudan a prevenir el desarrollo de grietas y fisuras en la piel que pueden convertirse en úlceras cutáneas. La curación rápida de la piel rota y agrietada, antes de que se produzca una infección, es muy importante.

A menudo, el daño cutáneo en pacientes diabéticos es relativamente fácil de curar. La mejor manera es prelavar la piel afectada con peróxido de hidrógeno al 3% seguido de la aplicación de cremas que contengan SRCP. En la fotografía de la izquierda, una mujer con diabetes tenía seis úlceras cutáneas en el pie y los médicos recomendaban la amputación inmediata. En su lugar, probó los lavados con peróxido de hidrógeno seguidos de la aplicación del péptido de cobre en la periferia de las úlceras cutáneas. Las fotografías de la izquierda son a ambos lados del pie antes de este procedimiento y las de la derecha son después de 28 días de peróxido de hidrógeno y la crema de péptido de cobre. Después de 28 días se curaron todas las úlceras cutáneas. Las úlceras nunca volvieron a aparecer y solo usó producto adicional cuando fue necesario cuando su piel se irritó y agrietó excesivamente.

Para la piel agrietada, use una capa ligera de péptido de cobre una vez al día según sea necesario. Para las úlceras cutáneas, coloque el péptido de cobre alrededor del borde de las úlceras. Esto ayuda a que la piel se cure desde el borde exterior de las úlceras. NOTA: Los péptidos de cobre no están aprobados por la FDA para su uso dentro del área de la úlcera.

Algunos médicos recomiendan no usar peróxido de hidrógeno en la piel dañada y afirman que aumenta el daño cutáneo. Sin embargo, mis revisiones de los últimos 70 años de literatura médica han encontrado muchos informes de mejoría en la cicatrización de la piel después de lavados con peróxido de hidrógeno en concentraciones bajas (1% a 10%). Sin embargo, ocasionalmente se observa daño en la piel a concentraciones más altas de peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, cualquier uso de peróxido de hidrógeno en la piel dañada debe usar concentraciones del 1% al 3% y no más.


Niveles de dosificación clínica de GHK-Cu y farmacocinética de degradación rápida in vivo

Si bien las acciones biológicas de GHK y GHK-Cu comienzan en 10exp (-12) M y alcanzan un pico en aproximadamente 10exp (-8) M, los estudios clínicos han utilizado dosis mucho más altas. Puede haber explicaciones para esta divergencia. Cuando se aplican cremas que contienen GHK-Cu en heridas o piel intacta, los niveles de absorción son muy bajos, oscilando entre 0,05 y 0,15%. Alternativamente, cuando se inyecta GHK-Cu por vía intradérmica o en el margen de una herida. La GHK se elimina rápidamente del área con una eliminación de más del 95% en 1 minuto. En ratones, tiene una vida media de aproximadamente 20 minutos cuando se inyecta por vía intraperitoneal. Se descompone rápidamente en glicina y lisil-histidina libres, que se excretan rápidamente. (Determinación simultánea de glicil-L-histidil-L-lisina y su metabolito, L-histidil-L-lisina, en plasma de rata mediante cromatografía líquida de alta resolución con derivatización posterior a la columna, Endo T Miyagi M Ujiie A (Kissei Pharmaceutical Co ., Ltd., Minamiazumi, Nagano, Japón) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 abril 25692 (1): 37-42)

Mejora de la cicatrización sistémica de heridas con GHK-Cu

GHK-Cu se puede utilizar para mejorar la reparación sistémica de heridas en todo el animal. En conejos de 2,5 kilogramos, H. Paul Ehrlich descubrió que la inyección de 1 miligramo de GHK-Cu (formulado en una proporción de 2 moléculas de péptido por una molécula de cobre) en el tejido muscular estimuló notablemente la curación en áreas distantes del lugar de la inyección y aumentó la concentración de macrófagos circulantes de la herida. Si esta técnica se usara en humanos, la inyección de una cantidad muy pequeña de GHK-Cu (aproximadamente 30 miligramos) antes de una operación quirúrgica aceleraría la reparación del tejido. La cantidad de cobre contenida en 30 miligramos de GHK-Cu es aproximadamente la dosis diaria recomendada.

Tal técnica sería de gran valor en operaciones difíciles como la cirugía de trasplante de cadera en ancianos y en operaciones en pacientes inmunodeprimidos. Los experimentos con ratas inmunodeprimidas por H. Paul Ehrlich han encontrado que GHK-Cu normalizó la reparación de heridas en tales situaciones.

Trasplante de piel y cabello

GHK-Cu mejoró los trasplantes de injertos de piel en cerdos, ratones y humanos. Para los injertos de piel de cerdo, los mejores resultados se obtuvieron utilizando GHK-Cu disuelto en una pequeña cantidad de DMSO (dimetilsulfóxido). Normalmente, en los injertos de piel, la mayor parte de la piel injertada muere y la piel nueva crece hacia afuera desde el núcleo superviviente del injerto de piel. Sin embargo, la adición de DMSO a menudo mejoraba tanto la "toma" del injerto que el área de "toma" del injerto final excedía el tamaño real del injerto de piel.

Estudio Resultado Referencia
Patentes de EE. UU. Que describen métodos que utilizan GHK-Cu para estimular la cicatrización de heridas y métodos para mejorar la cicatrización de heridas a través de un animal Patente de EE.UU. 4.665.054 Nuevos derivados de cobre de glicil-L-histidil-L-lisina de resistencia mejorada a las enzimas proteolíticas y mejor solubilidad en grasas para su uso en la inhibición de la producción de tromboxano y la mejora de la cicatrización de heridas. Patente de EE.UU. llagas Pickart Patente de EE. UU. 4.877.770 Nuevos compuestos de complejo de cobre de éster de glicil-histidil-lisina con actividad antiinflamatoria y superóxido dismutasa útiles para mejorar la cicatrización de heridas
Pickart Patente de EE.UU. 4.937.230 Método para curar heridas en caballos utilizando un complejo de cobre de Glycil-L-Histidil-L-lisina o derivados en el área afectada. Pickart Patente de Estados Unidos 5.164.367 Composiciones para acelerar la cicatrización de heridas en mamíferos que contienen sal cúprica o complejos con aminoácidos o péptidos
Cicatrización de heridas en ratas Aceleración de la cicatrización de heridas utilizando glicil-histidil-lisina cobre (II) Downey, Larrabee, Voci y Pickart (Virginia Mason Research Center) Surg. Foro 573-575, 1985
Curación de heridas de rata Quimioatracción de células endoteliales capilares Acciones antioxidantes Se probó GHK-Cu en la curación de heridas de rata, quimioatracción de células capilares y actividad similar a la superóxido dismutasa. GHK-Cu aceleró la curación de heridas de rata y actuó como quimioatrayente para las células endoteliales capilares a 10exp (-12) M. GHK-Cu también posee una actividad similar a la superóxido dismutasa significativa. Gly-l-his-l-lys copper (II): un factor de crecimiento humano con actividades similares a la superóxido dismutasa y cicatrización de heridas Pickart, Downey, Lovejoy y Weinstein (Universidad de Washington) En: Superóxido y superóxido dismutasa (Elsevier, 1986) págs. 555-558
Curación de heridas y trasplante de piel en ratones. GHK-Cu se probó mediante inyección para mejorar la cicatrización de heridas quirúrgicas y la toma de injertos de piel GHK-Cu aceleró la cicatrización de la herida quirúrgica y mejoró la toma de injertos de piel Iamin: un factor de crecimiento humano con múltiples propiedades de cicatrización de heridas Pickart In: Biology of Copper Complexes Plenum Press 1987, pp.273-282
Curación de heridas en ratones. Se probó GHK-Cu para mejorar el cierre de heridas quirúrgicas GHK-Cu aceleró la curación de heridas quirúrgicas en ratones Actividad biológica del factor de crecimiento de unión al cobre en plasma humano glicil-L-histidil-L-lisina. Métodos Pickart y Lovejoy Enzymol 1987147: 314-28
Cicatrización de heridas en cerdos Periferia de la herida inyectada con 50 microgramos de GHK-Cu en DMSO al 1%. Las heridas de control recibieron solo DMSO al 1%. A los 17 días después de la herida, GHK-Cu aceleró la cicatrización e indujo un patrón de "estrella" de fuerte contracción de la herida. Pickart, 1984, inédito
Cicatrización de heridas en cerdos Se determinó la cicatrización de heridas por biopsias con punch en cerdos. GHK-Cu estimuló notablemente la cicatrización de heridas y la síntesis de colágeno. El efecto está muy localizado en el área inmediata de la piel que se trata. Counts, D, Hill E, Turner-Beatty M, Grotewiel M, Fosha-Thomas S, Pickart L. Efecto de lamin en la cicatrización de heridas de espesor total. Fed Am Soc Exp Biol 1992 A1636
Curación de la pata en perros GHK-Cu probado en la curación de la pata en perros. El complejo tripéptido-cobre mejoró la cicatrización de las heridas de las almohadillas en 12 Pointers ingleses maduros. La producción de colágeno fue significativamente mayor en las almohadillas tratadas. La curación fue mejor con un vendaje ligero. Los vendajes húmedos anularon el efecto tripéptido-Cu.
Heridas quirúrgicas de perros Efecto de GHK-Cu y GHKF-Cu sobre la cicatrización de heridas quirúrgicas en perros. GHK-Cu y GHKF-Cu aumentaron el cierre y la contracción de la herida y aumentaron notablemente la producción de tejido de granulación.
Humanos: úlceras por estasis venosa refractarias y úlceras diabéticas Se probó el efecto de la crema no iónica GHK-Cu con un mínimo de conservante en 60 pacientes La crema GHK-Cu aceleró la reepitelización de la herida Efectos del tripéptido glicil-l-histidil-l-lisina cobre (II) sobre la cicatrización. Correlaciones clínicas y bioquímicas. Aupaix, Maquart, Salagnac, Pickart, Gillery, Borel y Kalis J Invest Derm 94: 390, 1990
Humanos - Heridas quirúrgicas agudas Crema GHK-Cu probada con alcohol benzoílico como conservante en la cicatrización después de la cirugía de Moh. GHK-Cu aumentó la cicatrización de heridas y la reepitelización de la piel Fish S, Katz I, Hien NR, Briden ME, Johnson JA, Patt, L, Evaluación del complejo de cobre glicil-1-histidil-1-lisina en la cicatrización de heridas agudas. Heridas 1991, 3: 171-177
Curación en ratas inmunodeprimidas Estimulación de la cicatrización de la piel en ratas inmunodeprimidas H. P. Ehrlich (Escuela de Medicina de Harvard, Boston, EE. UU.) Presentado en el Simposio sobre colágeno y reparación de la piel en Reims, Francia, del 12 al 13 de septiembre de 1991
Úlceras cutáneas humanas - diabéticas Massey P, Patt L, D'Aoust JC, Los efectos del quelato de cobre de glicil-l-histidil-l-lisina en la curación de úlceras diabéticas, Heridas 4: 21-28, 1992
Úlceras cutáneas humanas - diabéticas Crema de GHK-Cu probada para la cicatrización de úlceras cutáneas GHK-Cu aumento de la reepitelización de la úlcera cutánea Los efectos combinados del glicil-l-histidil-l-lisina cobre (II) y Cell-Tak en la cicatrización de heridas de incisión lineal. Schmidt SP, Resser JR, Sims RL, Mullins DL y Smith DJ (Universidad de Akron, Ohio, EE. UU.) Heridas 6, 62-67, 1994
Curación de heridas y producción de fibroblastos de colágeno en cobayas Se examinaron los efectos de GHK-Cu y tres análogos sintéticos sobre la cicatrización de heridas de la piel dorsal de cobaya, así como sobre fibroblastos cultivados. Se midieron hidroxiprolina, proteínas, ADN y amino oxidasa sensible a semicarbazida, con alta afinidad por la bencilamina, y se observó la histología de las heridas después de la tinción con hematoxilina / eosina. GHK-Cu y los análogos causaron una disminución de la actividad de Amino oxidasa sensible a semicarbazida, con alta afinidad por la bencilamina, 4-8 días después de la cirugía, seguida de un aumento en el día 11 que fue mayor que en el grupo de control. Con estos complejos péptido-Cu se observa una reorganización más lenta de la piel y una activación retardada de los fibroblastos. Los péptidos tuvieron un efecto directo sobre los fibroblastos. Los productos a una concentración de 10exp (-7) M, disminuyeron la reproducción celular y aumentaron la expresión de colágeno. Efecto de los complejos tripéptido-cobre sobre el proceso de cicatrización de heridas cutáneas y sobre fibroblastos cultivados. Buffoni, Pino y Dal Pozzo (Departamento de Farmacología, Universidad de Florencia, Florencia, Italia) Arch Int Pharmacodyn Ther 1995 330 (3): 345-60
Ratones El uso de péptidos de cobre resistentes a la degradación para estimular la reparación de la piel y la cicatrización de heridas. Patente de EE.UU. 5.382.431 Composiciones regeneradoras y protectoras de tejidos Pickart
Reparación de piel humana Dermatitis de contacto con níquel in vivo: modelo humano para terapias tópicas. Zhai, Chang, Singh y Maibach (Universidad de California, San Francisco, EE. UU.) Dermatitis de contacto Vol. 40, págs.205-208, 1999
Reparación de piel humana Modelo de piel desnuda para predecir el potencial de irritación de agentes tópicos in vivo en el hombre. Zhai, Poblete y Maibach (Universidad de California, San Francisco, EE. UU.) Revista internacional de dermatología, volumen 37, páginas 386-389, 1998
Reparación de piel humana Lauril sulfato de sodio piel dañada in vivo en el hombre: un modelo de reparación de la barrera del agua. Zhai, Leow y Maibach (Universidad de California, San Francisco, EE. UU.) Investigación y tecnología de la piel, volumen 4, páginas 24-27, 1998
Reparación de piel humana Recuperación de la barrera humana después de la perturbación aguda de la acetona: un modelo de dermatitis irritante. Zhai, Leow y Maibach (Universidad de California, San Francisco, EE. UU.) Dermatología clínica y experimental, volumen 23, páginas 11-13, 1998
Efecto de GHK-Cu sobre la cicatrización de heridas abiertas isquémicas en ratas. GHK-Cu provocó una disminución significativa en el área de la herida (64,5% GHK-Cu frente al 28,2% de control) el día 13. GHK-Cu también redujo significativamente las concentraciones de TNF-alfa y MMP-2 y MMP-9.

Canapp SO Jr, Farese JP, Schultz GS, Gowda S, Ishak A.M, Swaim SF, Vangilder J, Lee-Ambrose L, Martin FG, El efecto del complejo de cobre-tripéptido tópico en la curación de heridas abiertas isquémicas, Vet Surg. 2003 noviembre-diciembre 32 (6): 515-23
Reparación cutánea dérmica de rata La biotina se unió a GHK y luego se unió a películas de colágeno. Esto aumentó la contracción de la herida, aumentó la proliferación celular y produjo una alta expresión del antioxidante superóxido dismutasa. Los niveles de cobre tisular aumentaron 9 veces. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, Jayakumar R. Péptido GHK biotinilado incorporado matriz de colágeno: un biomaterial novedoso para la cicatrización de heridas dérmicas en ratas. Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Mayo 73 (2): 383-91
Compare las cremas de óxido de zinc y GHK-Cu para la cicatrización de heridas El área de la herida sin cicatrizar fue más pequeña y la contracción de la herida fue mayor en el GHK-Cu que en el grupo de óxido de zinc y el control. El tiempo medio de cobertura del lecho de la herida con tejido de granulación fue significativamente más corto en el grupo de GHK-Cu que en los otros grupos. El llenado de la herida abierta con tejido de granulación hasta el nivel de la piel fue significativamente más lento en el grupo de control que en los otros dos grupos. La neovascularización se observó mejor en el grupo de GHK-Cu. Los autores sugieren que GHK-Cu es una mejor opción en los protocolos de tratamiento de heridas abiertas que el óxido de zinc.
Se probó el péptido GHK biotinilado (BioGHK) con biomaterial de colágeno incorporado (PIC) para la cicatrización de heridas en ratas diabéticas. En ratas diabéticas tratadas con colágeno BioGHK, la cicatrización se aceleró con una mayor tasa de contracción de la herida. Los niveles de glutatión (GSH) y ácido ascórbico en la piel de ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina fueron más altos en el grupo PIC en comparación con los grupos de control (sin tratar) y tratados con colágeno (película de colágeno - CF). La actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) se alteró en todos los grupos. Los estudios de cultivo de células de fibroblastos sugieren que PIC promueve el crecimiento de fibroblastos, revela epitelización, aumento de la síntesis de colágeno y activación de fibroblastos y mastocitos en el grupo PIC. El colágeno incorporado de BioGHK puede ser un enfoque para mejorar la cicatrización de heridas diabéticas.

Fotografía:
Izquierda - Injerto de control alrededor del 20% del injerto de piel (en el centro) establecido; esta es una "toma" típica del injerto.
Derecha - Injerto empapado en GHK-Cu en liposomas. Área de trasplante de sobrecrecimiento del injerto original

.

Estudio Resultado Referencia
Mejora de los injertos de piel en porcinos Patente de Estados Unidos 4.760.051 de Pickart Las composiciones que contienen glicil-1-histidil-1-lisina cobre (II) mejoran el proceso de cicatrización de heridas sin provocar una respuesta antigénica.
GHK-Cu probado en trasplantes de piel en ratones Injertos de piel de espesor total trasplantados de 1,5 cm de diámetro en ratones. Esto se considera un experimento de trasplante "imposible". El 40% de los trasplantes de espesor total se convirtieron en injertos permanentes. Pickart Iamin: un factor de crecimiento humano con múltiples propiedades curativas de heridas. en Biology of Copper Complexes, Clifton, NJ, 1987, págs. 273-285.
Trasplantes de cabello humano .Estudió el efecto del análogo GHK-Cu en los trasplantes de cabello. Los pacientes tratados vieron un nuevo crecimiento de cabello en seis semanas, en comparación con las 10 a 14 semanas normales. En la mayoría de los casos, la formación de costras en la piel después del trasplante se reduce de 10 a 14 días a cinco días. Aumentó el grado de crecimiento del cabello de los trasplantes de cabello humano. Perez-Meza et al, (Revista Internacional de Cirugía Cosmética (Vol. 6, 1998, págs. 80-84)
Trasplantes de cabello humano 30 pacientes con trasplante de cabello, encontraron que el análogo de GHK-Cu redujo la caída del cabello trasplantado del 30 por ciento con solución salina al 10 por ciento. El tiempo de curación de los injertos trasplantados se redujo a la mitad.El recrecimiento de cabello nuevo de los trasplantes se produjo en seis a ocho semanas con solución salina y de cuatro a seis semanas con el análogo de GHK-CU. La satisfacción del paciente después del trasplante aumentó del 80 al 95 por ciento. Hitzig, G. Mejora de la cicatrización y el crecimiento en el trasplante de cabello utilizando péptidos de cobre, Cosmetic Dermatol 2000 (junio) 13, 18-21

La GHK se aisló originalmente por sus acciones para aumentar la supervivencia de cultivos de órganos de hígado de rata. GHK también aumenta la reparación del daño hepático en ratas.

Se probó GHK-Cu para la curación del tejido óseo

Crecimiento de condrocitos óseos

Se estudió el efecto de GHK-Cu sobre la estimulación de la producción de hueso nuevo en cobayas.Los autores prepararon geles de colágeno al 7,5% y 12,5%, suplementados con el tripéptido GHK-Cu, perfloxacina y glucosaminoglicano hipersulfatado (HSGAG).

GHK-Cu estimula la curación ósea en animales y las funciones de las células de reparación ósea en cultivo. El desarrollo de GHK-Cu para uso clínico se está llevando a cabo bajo la dirección del Prof. Milan Adam (Universidad de Praga, Fotografía - a la izquierda). Adam desarrolló un copolímero de colágeno-injerto-glicosaminoglicano suplementado con GHK-Cu para la curación ósea.


Acciones antiinflamatorias: tejido dañado

Las acciones antioxidantes de GHK y GHK-Cu que ayudan a proteger el tejido lesionado parecen tener múltiples acciones. Estos son (1) un antiinflamatorio directo del complejo cobre-péptido, (2) una actividad que bloquea la liberación de hierro libre de las moléculas de ferritina, (3) una capacidad para bloquear el daño tisular causado por la interleucina-1 en un GHK -Cu concentración de aproximadamente 10exp (-10) M, y (4) capacidad para bloquear la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) por el cobre libre.

Acciones antioxidantes

Las reacciones entre los iones de níquel y GHK y oligopéptidos similares se caracterizaron mediante experimentos de captura de espín.

GHK-Cu poseía superóxido dismutasa y actividades similares a catalasa.

Beretta G, Artali R, Regazzoni L, Panigati M, Facino RM, Glycyl-histidyl-lysine (GHK) es un inhibidor de alfa, beta-4-hidroxi-trans-2-nonenal: una comparación con la carnosina. conocimientos sobre el mecanismo de reacción mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización, 1H RMN y técnicas computacionales.
Chem Res Toxicol. 20 de septiembre de 2007 (9): 1309-14.

Beretta G, Arlandini E, Artali R, Anton JM, Maffei Facino R.

Capacidad de secuestro de acroleína del tripéptido endógeno glicil-histidil-lisina (GHK): Caracterización de productos de conjugación por ESI-MS (n) y cálculos teóricos.
J Pharm Biomed Anal. 2008 julio 1547 (3): 596-602.

Acciones antiinflamatorias: General

Acciones antioxidantes y antiinflamatorias de GHK y GHK-Cu

GHK y GHK-Cu pueden funcionar como antiinflamatorios no esteroides humanos (AINE) circulantes. En el plasma humano hay alrededor de 200 nanogramos por mililitro de GHK y GHK-Cu a los 20 años. Esto disminuye a alrededor de 80 nanogramos por mililitro a los 60 años, pero estos niveles son muy variables. Dadas las constantes de unión respectivas para el cobre (+2) entre la GHK y la albúmina en el plasma humano, es probable que solo alrededor del 10% de la GHK circulante esté quelada con cobre (+2). En áreas de daño tisular, esta proporción podría ser más alta debido a la disminución de las concentraciones de albúmina. Existen similitudes muy cercanas entre las estructuras químicas tridimensionales de GHK-Cu y los antagonistas de los receptores H2 utilizados como medicamentos antiulcerosos como cimetidina, ranitidina, famotidina y nizatidina. Dado que el GHK-Cu es un componente normal de la saliva presente en aproximadamente 40 nanogramos / mililitro, puede funcionar como un protector natural de los revestimientos gastrointestinales. Además, los medicamentos antiulcerosos más comunes son potentes aglutinantes de cobre iónico (II). También existen similitudes, aunque menos obvias, entre la mayoría de los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NAISD) y GHK. Prácticamente todos los AINE se unen ávidamente al cobre (+2).

Estudio Resultado Referencia
Desarrollo de análogos protectores de tejidos de GHK-Cu Se probaron GHK-Cu y sus análogos para determinar las propiedades antioxidantes y protectoras de los tejidos. Se encontró que GHK-Cu y los análogos mejoran o restauran la resistencia al daño oxidativo o inflamatorio. Ciertos análogos fueron 100 veces más efectivos que GHK-Cu. Patente de EE.UU. 5.118.665 Nuevos complejos de péptidos metálicos antioxidantes y antiinflamatorios que contienen residuos de glicina, histidina y lisina utilizados para mejorar o restaurar la resistencia al daño oxidativo o inflamatorio. Pickart
Bloqueo de la oxidación del hierro Un estudio sobre si algunas de las propiedades de cicatrización de heridas de GHK-Cu se deben a un efecto sobre el metabolismo del hierro. La presencia de complejos de hierro en los tejidos dañados es perjudicial para la cicatrización de heridas, debido a la inflamación local, así como a la infección microbiana mediada por el hierro. Los efectos de GHK: Cu (II) sobre la peroxidación lipídica catalizada por hierro. GHK: Cu (II) inhibió la peroxidación de lípidos si la fuente de hierro era ferritina. Mientras que GHK: Cu (II) inhibió la liberación de hierro ferritina, no mostró una actividad significativa de tipo superóxido dismutasa o ceruloplasmina. Parece que GHK-Cu se une a los canales de ferritina implicados en la liberación de hierro y evita físicamente la liberación de la tasa). Por tanto, un efecto biológico de GHK: Cu (II), relacionado con la cicatrización de heridas, puede ser la inhibición de la liberación de ferritina de hierro en los tejidos dañados, previniendo la inflamación y las infecciones microbianas. Efectos del Cu (II) quelado con glicil-histidil-lisilo sobre la peroxidación lipídica dependiente de ferritina. Miller, DeSilva, Pickart, Aust. Pickart and Aust (Centro de Biotecnología, Universidad Estatal de Utah, Logan, UT, EE. UU.) Adv. Exp Med Biol 1990264: 79-84
Hallazgo de superóxido dismutasa y actividades similares a catalasa en complejos de níquel GHK Química redox de complejos de níquel) con algunos péptidos biológicamente importantes en presencia de especies de oxígeno reducidas. Coterie N Tremolieres E Berliner JCL Cattier JP Henichart JP (INSERM, Ill, Francia) J Internat BioPharm 1992 Apr46 (1): 7-15
Acciones citoprotectoras frente a los radicales libres de oxígeno GHK-Cu inhibió notablemente el tejido de la mucosa intestinal de la peroxidación de lípidos por radicales libres derivados del oxígeno. Alberghina M, Lupo G, La Spina G, Mangiameli A, Gulisano M, Sciotto D, Rizzarelli E, Efecto citoprotector de los complejos de cobre (II) contra el daño inducido por etanol en la mucosa gástrica de rata, J Inorg Biochem. 45 de marzo de 1992 (4): 245-59.
Protección antioxidante de las células secretoras de insulina después de una lesión. La interleucina beta (IL-1 beta) se libera durante las lesiones y después de un daño tisular. IL-1 inhibe la liberación de insulina por las células pancreáticas. El estudio probó si GHK-Cu bloquearía el daño de IL-1 a las células pancreáticas secretoras de insulina. Se incubaron células de islotes pancreáticos de rata con o sin 50 U / ml de IL-1 beta, en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Cu (II) -GHK o CuSO4 (1-1000 ng / ml). Después de la incubación, se evaluó la secreción de insulina en presencia de 2,8 mmol / l (secreción basal de insulina) o de 16,7 mmol / l de glucosa (liberación inducida por glucosa). En los islotes de control, la secreción de insulina basal fue de 92 +/- 11 (pg / islote) y la liberación inducida por glucosa fue de 2824 +/- 249. En los islotes preexpuestos a 50 U / ml de IL-1 beta, la liberación de insulina basal no fue significativamente afectada, pero la liberación de insulina inducida por glucosa se redujo en gran medida (841 +/- 76). En los islotes incubados con IL-1 beta y Cu-GHK (0,4 mumol / l, efecto máximo), la secreción basal fue 119,0 +/- 13 y la liberación inducida por glucosa fue 2797 +/- 242. CuSO4 no tuvo acciones protectoras. La adición de cobre previene los efectos inhibidores de la interleucina 1-beta en los islotes pancreáticos de ratas, Vinci, Caltabiano, Santoro, Rabuazzo, Buscema, Purrello, Rizzarelli, Vigneri y Purrello (Endocrinología médica de la Universidad de Catania, Facultad de medicina de la Universidad de Catania, Italia) Diabetologia 1995 38 (1): 39-45
Efecto de GHK sobre el bloqueo del daño oxidativo que produce la enfermedad de Alzheimer El cobre (II) débilmente unido puede producir la oxidación de la proteína amiloide de la enfermedad de Alzheimer y causar neurodegeneración El cobre (II) débilmente unido puede producir oxidación de la proteína amiloide de la enfermedad de Alzheimer y causar neurodegeneración La proteína precursora amiloide de la enfermedad de Alzheimer en la reducción de cobre (II) a cobre (I). Multhaup Schlicksupp Hesse Beher Ruppert Masters Beyreuther (ZMBH-Center for Molecular Biology University of Heidelberg, Alemania) Science 1996 Mar 8271 (5254): 1406-9
Aumenta la superóxido dismutasa en heridas. La biotina se unió a GHK y luego se unió a películas de colágeno. Esto aumentó la contracción de la herida, aumentó la proliferación celular y produjo una alta expresión del antioxidante superóxido dismutasa. Los niveles de cobre tisular aumentaron 9 veces. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, Jayakumar R. Péptido GHK biotinilado incorporado matriz de colágeno: un biomaterial novedoso para la cicatrización de heridas dérmicas en ratas. Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Mayo 73 (2): 383-91
GHK desintoxica el 4-hidroxi-2-nonenal, una molécula tóxica GHK bloquea las acciones tóxicas del 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), un producto de descomposición de ácidos grasos que se considera causante del desarrollo de diabetes, nefropatía, retinopatía y enfermedades neurodegenerativas.
Los bloques GHK bloquean la producción de acroleína La acroleína es una toxina creada por radicales carbonilo de ácidos grasos poliinsaturados. GHK desintoxica la acroleína. Los autores sugieren que la GHK puede ser valiosa en la prevención de la aterosclerosis, la diabetes, la neuropatía y la enfermedad de Alzheimer.
Similitudes entre GHK y productos farmacéuticos anti-úlceras
Tenga en cuenta los 3 componentes principales:
(1) un cambio de lado de N-terminal,
(2) y anillo de imidazol central,
(3) un grupo C-terminal - similar a la lisina - muy básico

Curación intestinal y estomacal

GHK-Cu tiene efectos potentes sobre la curación de úlceras de estómago e inflamaciones intestinales. Un pequeño estudio en humanos encontró un efecto muy positivo de GHK-Cu en la curación de lesiones intestinales en personas con enfermedad inflamatoria intestinal refractaria.

Efectos de GHK-Cu sobre la acidez gástrica, la producción de moco y el desarrollo de úlceras
(Modelo de úlcera gástrica de Shay (etanol al 95%) en ratas)
Dosis de GHK-Cu PH del estómago Ratas con úlceras gástricas visibles Producción de mucosa gástrica
ninguno 2.3 72% No observable
1 miligramo 3.8 33% ++
3 miligramos 4.7 ninguno ++++
10 miligramos 6.7 ninguno ++++

Asimismo, GHK-Cu produjo un bloqueo similar de la formación de úlcera duodenal de rata (inducida por cistamina).

Curación de úlceras intestinales y de estómago

Se probó GHK-Cu para la curación de úlceras de estómago experimentales y daño intestinal en ratas.

GHK-Cu curó las úlceras de estómago experimentales y la inflamación y el daño intestinal

Alberghina M, Lupo G, La Spina G, Mangiameli A, Gulisano M, Sciotto D, Rizzarelli E, Efecto citoprotector de los complejos de cobre (II) contra el daño inducido por etanol en la mucosa gástrica de rata, J Inorg Biochem. 45 de marzo de 1992 (4): 245-59.

Se trató a 16 pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal refractaria con soluciones de GHK-Cu administradas por vía rectal.

Después del tratamiento de 12 semanas, hubo una reducción del 60% en la gravedad básica medida por endoscopia, histopatología y síntomas.

Estudio Resultado Referencia
Curación de úlceras estomacales e intestinales. Pickart Patente de EE.UU. 4.767.753 Complejos de cobre de polipéptido (s) de histidil-lisina para reducir las secreciones del estómago, aumentar la mucosa del estómago y prevenir las úlceras. Patente de EE.UU. 5.023.237 Uso de polipéptido o su complejo de cobre para citoprotección en el tratamiento de úlceras intestinales y de estómago y para facilitar la cicatrización de heridas. Patente de Estados Unidos 5.145.838 Métodos y composiciones para curar úlceras y derivados de péptidos.
Acciones citoprotectoras frente a los radicales libres de oxígeno GHK-Cu inhibió notablemente el tejido de la mucosa intestinal de la peroxidación de lípidos por radicales libres derivados del oxígeno. Un estudio abierto de la solución rectal PC1020 (GHK-Cu) en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal distal. Levine, Patt, Koren (Universidad de Washington) Congreso Mundial de Dermatología, octubre de 1994, más detalles presentados en la 25a Reunión Anual de DDW, Levien, Patt, Koren, Joslin (Universidad de Washington) mayo de 1995

Anti-dolor, anti-ansiedad, confianza en uno mismo

GHK posee acciones contra el dolor, la ansiedad y probablemente una mayor confianza en sí mismo. Tales acciones podrían haber surgido como un mecanismo evolutivo para aumentar la supervivencia de un animal después de lesiones físicas.

El efecto anti-dolor en ratas comienza a 0.5 miligramos / kg mientras que los efectos ansiolíticos comienzan a 0.5 microgramos / kg, que es el nivel que los grupos rusos y ucranianos observaron cicatrización de heridas dérmicas y huesos.

Bobyntsev II, Chernysheva OI, Dolgintsev ME, Smakhtin MI, Belykh AE. [Efecto del péptido Gly-His-Lys y sus análogos sobre la sensibilidad al dolor en ratones]. [Artículo en ruso]. Eksp Klin Farmakol. 201578 (1): 13-5.

Aplicación de péptido gly-his-lys de efecto analgésico en el dolor causado por la irritación térmica.

Véase también la patente RU 2421235.

Bobyntsev II, Chernysheva OI, Dolgintsev ME, Smakhtin, Belykh AE. Efectos ansiolíticos del péptido gly-his-lys y sus análogos. Bull Exp Biol Med 2015 Abril 158: 72608.

Chernysheva O.I. 1, Bobyntsev I.I. 1, Dolgintsev M.E. LA INFLUENCIA DEL TRIPÉPTIDO GLY-HIS-LYS EN EL COMPORTAMIENTO DE LAS RATAS EN LA PRUEBA & laquoOPEN FIELD & raquo

Universidad Estatal de Medicina de Kursk

Un entrenador llamó a Skin Biology y dijo que los luchadores se inyectaban 1 miligramo de GHK antes de las peleas importantes para aumentar su confianza en sí mismos y sanar más rápido después del combate.

Es posible que el GHK aumente la confianza en uno mismo. En algunos de los experimentos con ratas, la dosis eficaz fue de 0,5 microgramos / kg. Si se vuelve a calcular para un peso humano de 70 KG, entonces 0,035 miligramos serían efectivos. Entonces el miligramo usado por los combatientes puede ser suficiente.

Bioquímica de SRCP relacionada con la regeneración de tejidos

Cuando la cicatrización de heridas es inadecuada, el área curada a menudo carece de capacidades sensoriales.

Estudió el efecto de GHK sobre el crecimiento nervioso.

Gly-His-Lys apoyó la diferenciación y viabilidad de las neuronas de pollo en el cultivo celular de varias neuronas: embrión de pollo PNS (ganglio trigeminale) y del SNC de ratas embrionarias (hipocampo) y células disociadas del tejido cerebral de embriones de pollo. Las concentraciones óptimas de GHK para el crecimiento neuronal fueron 10 ng / ml. GHK aumentó la proporción de neuronas a células gliales en cultivo.

GHK y producción de energía celular

Se probó el efecto de GHK sobre la activación de la fosfoilasa A.

GHK estimuló de forma dosis-dependiente la actividad de la fosforilasa a en hepatocitos aislados de rata. Este efecto se asoció con aumentos tanto en la producción de IP3 como en [Ca ++]. Estos efectos de Gly-His-Lys fueron antagonizados por losartán, un antagonista del receptor de angiotensina II no peptídico (selectivo de AT1), lo que sugirió que estos receptores estaban involucrados en su efecto. Los experimentos de competición de unión indicaron claramente que Gly-His-Lys interactúa con los receptores AT1.

Estudio Resultado Referencia
Búsqueda en el banco de datos de la fuente de GHK humana - Efecto de GHK-Cu en la síntesis de colágeno Determinadas posibles fuentes de GHK y efecto de GHK-Cu sobre la síntesis de colágeno en dos cepas de fibroblastos humanos y fibroblastos de pulmón embrionario. GHK es una secuencia muy rara que aparece en solo 8 secuencias de proteínas humanas a partir de 1990. Aparece tres veces en el colágeno y también existe en varias proteínas inflamatorias - Todas las líneas de fibroblastos estimularon la síntesis de colágeno a 10exp (-12) M y como máximo a 10exp (- 9) M La glicil-l-histidil-l-lisina, un triplete de la cadena a2 (I) del colágeno de tipo I humano, estimula la síntesis de colágeno mediante cultivos de fibroblastos Maquart, Gillery, Monboisse, Pickart, Laurent y Borel Ann. N.Y. Acad. Sci. 580: 573-575, 1990
Buscar fuente de GHK Estudios sobre una proteína estructural de la piel llamada SPARC. GHK y HGHK, dos péptidos con una afinidad de unión al cobre muy alta, son angiogénicos. Se generan por la descomposición de SPARC, una proteína estructural de la piel rica en cisteína. SPARC puede funcionar a varios niveles para controlar la progresión de los neovasos. La proteólisis de SPARC por plasmina da como resultado la liberación de péptidos que contienen la secuencia Gly-His-Lys, que son angiogénicos in vitro e in vivo. En etapas posteriores de la angiogénesis, cuando cesa la proliferación de células endoteliales, SPARC puede ejercer efectos inhibidores sobre la angiogénesis. Regulación de la angiogénesis por matriz extracelular: el crecimiento y la cola. Sage y Vernon (Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.) J Hypertens Suppl 1994 12 (10): S145-52
Efecto de GHK sobre la quimioatracción de las células inmunitarias asociadas a la curación Se comparó GHK con potentes quimioatrayentes y análogos de GHK conocidos. GHK fue el quimioatrayente más potente probado para los mastocitos, pero Gly-His-Gly, His-Lys e His-Gly-Gly estaban inactivos. Estimulación de la migración de mastocitos peritoneales de rata por péptidos derivados de tumores. Cáncer de Poole y Zetter (Facultad de Medicina de Harvard). Res. 43, 5857-5861, 1983
Efecto de GHK sobre la quimioatracción de las células inmunitarias asociadas a la curación Se comparó GHK con potentes quimioatrayentes y análogos de GHK conocidos. Se utilizó un dispositivo implantable para el estudio de la quimioatracción de leucocitos en ratas durante un máximo de 18 días. GHK atrajo células inmunes que curan heridas (mastocitos, macrófagos, leucocitos polimorfonucleares) a aproximadamente 10exp (-10) M. Un ensayo in vivo de actividad quimioatrayente. Zetter, Rasmussen y Brown (Facultad de Medicina de la Universidad de Harvard, Boston, MA, EE. UU.) Lab Invest 1985 53 (3): 362-8
Se cree que la heparina media en algunos eventos curativos. GHK-Cu y heparina, que es un anticoagulante natural y un mediador de la cicatrización de heridas. Se encontró que GHK se une a la heparina en estudios de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Unión del factor de crecimiento glicil-L-histidil-L-lisina por heparina. Rabenstein, Robert y Hari (Universidad de California en Riverside, EE. UU.) FEBS Lett 1995, 376, págs. 216-20
Angiogénesis en modelo de córnea de conejo y migración de células capilares GHK-Cu probado para actividad angiogénica. Complejos de cobre de angiogénesis inducida por glicil-L-histidil-L-lisina y heparina en conejos. Los conejos deficientes en cobre no pueden inducir angiogénesis. Ceruloplasmina, iones de cobre y angiogénesis. Raju, Alessandri, Ziche y Gullino (Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD, EE. UU.) J Natl Cancer Inst 1982 69 (5): 1183-8
Angiogénesis en modelo de córnea de conejo y migración de células capilares GHK-Cu probado para actividad angiogénica y efecto sobre la migración de células capilares. Aumento de la angiogénesis en el modelo de córnea de conejo: aumento de la migración in vitro de células capilares en 8 veces Caracterización de un quimioatrayente para el endotelio inducido por efectores de angiogénesis. Raju, Alessandri, Gullino (Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD, EE. UU.) Cancer Res. 44: 1579-1584, 1984
Crecimiento nervioso - comentario
Crecimiento nervioso Estudió el efecto de GHK sobre el crecimiento nervioso. Gly-His-Lys apoyó la diferenciación y viabilidad de las neuronas de los pollos en el cultivo celular y aumentó la excrecencia nerviosa. Las concentraciones óptimas de GHK para la función neuronal fueron 100-400 ng / ml. Efectos del tripéptido sintético sobre la diferenciación de células nerviosas del hemisferio cerebral disociadas en cultivo. Sensenbrenner Jaros Moonen, Mandel (Universidad de Estrasburgo, Francia) Neurobiología 1975 5 (4): 207-13
Crecimiento nervioso Uber die Wirkung eines Synthetischen Tripeptids auf in vitro kultiviertes Nervengewebe (El efecto de un tejido nervioso tripéptido sintético cultivado in vitro), Lindner, Grosse, Halle y Henklein (Universidad Karl Marx, Berlín, Alemania) Z Mikrosk Anat Forsch 197993 (5): 820-8
Crecimiento nervioso Los nervios cortados se colocan en un tubo de colágeno impregnado con GHK. Esto provocó un aumento de la producción del factor de crecimiento nervioso y las neurotrofinas NT-3 y NT-4. Ahmed MR, Basha SH, Gopinath D, Muthusamy J, Jayakumar RJ, regulación ascendente inicial de factores de crecimiento y mediadores inflamatorios durante la regeneración nerviosa en presencia de tubos de colágeno incorporados con péptidos adhesivos celulares, J Peripher Nerv Syst. 2005, 10: 17-30
Se probó GHK para mantener la viabilidad de los fibroblastos en medio sin suero. Los fibroblastos de pollo se mantuvieron en medio sin suero después de la adición de GHK.El medio de cultivo que contiene GHK permitió estudiar los factores que afectan el metabolismo del colágeno sin las complicaciones de las proteínas del suero. Un modelo in vitro de fibroblasia: cuantificación simultánea de la proliferación, migración y síntesis de colágeno de fibroblasto. Graham, Diegelmann y Cohen (Medical College of Virginia, Richmond, VA, EE. UU.) Proc Soc Exp Bio Med 176, 302-308, 1984
Síntesis de colágeno en fibroblastos cultivados Se determinó el efecto de GHK-Cu. GHK-Cu estimuló la síntesis de colágeno en fibroblastos cultivados. La estimulación comenzó entre 10exp (-12) y 10exp (-11) M, maximizada a 10exp (-9) M, y fue independiente de cualquier cambio en el número de células. La presencia de un triplete de GHK en la cadena alfa 2 (I) del colágeno de tipo I sugiere que el tripéptido podría ser liberado por proteasas en el sitio de una herida y ejercer efectos curativos in situ. Estimulación de la síntesis de colágeno en cultivos de fibroblastos por el complejo tripéptido-cobre glicil-L-histidil-L-lisina-Cu2 +. Maquart, Pickart, Laurent, Gillery, Monboisse y Borel (Laboratoire de Biochimie, CNRS URA 84, Faculte de Medecine, Reims, Francia. FEBS Lett 1988, 238 (2): 343-6
Síntesis de colágeno en fibroblastos cultivados Se determinó el efecto de GHK-Cu sobre la producción de colágeno. GHK-Cu aumentó la síntesis de colágeno a 10exp (-9) M Requisito de la formación del complejo de cobre y tripéptido glicil-L-histidil-L-lisina para la actividad de síntesis de colágeno en fibroblastos dérmicos humanos normales. Oddos, T, Jumeau-Lafond, A Johnson & amp Johnson, Val de Reuil, Francia, Ries, G, Johnson & amp Johnson, Dusseldorf, Alemania Resumen P72, Reunión de la Academia Americana de Dermatología, febrero de 2002
Síntesis de glicosaminoglicanos sulfatados (proteínas de retención de agua) en fibroblastos cultivados. Se determinó el efecto de GHK-Cu sobre la síntesis de glicosaminoglicanos sulfatados (proteínas que retienen agua) en fibroblastos cultivados. GHK-Cu indujo un aumento dependiente de la dosis de la síntesis de los GAG totales secretados en el medio de cultivo y los asociados con la capa celular. El efecto de GHK-Cu aumentó con la dosis y fue óptimo a 10exp (-9) a 10exp (-8) M. Las concentraciones más altas tuvieron menos efecto sobre la velocidad de síntesis. GHK-Cu estimuló preferentemente la síntesis de dermatán sulfato extracelular y sulfato de heparina asociado a la capa celular. Estimulación de glicosaminoglicanos sulfatados por el complejo de cobre tripéptido glicil-l-histidil-l-lisina cobre (II). Wegrowski, Maquart, Borel (Universidad de Reims, Francia) Life Sci. 51, 1049-1056, 1992
Se determinaron los efectos de GHK-Cu sobre la síntesis de glicosaminoglicanos y pequeños proteoglicanos principales. Un estudio de los efectos de GHK-Cu in vivo, utilizando el modelo de cámara de heridas. Se implantaron cilindros de malla de alambre de acero inoxidable por vía subcutánea en el lomo de las ratas. Los fibroblastos cultivados tratados con GHK-Cu y las cámaras de heridas de las ratas tuvieron un aumento en el ARN mensajero para la decorina en lugar de para el biglicano. En ambos sistemas, GHK-Cu aumentó la síntesis de decorina, sulfato de dermatina y sulfato de condroitina. Expresión de glicosaminoglicanos y pequeños proteoglicanos en heridas: Modulación por el complejo tripéptido de cobre glicil-histidil-lisina Cu (II). Simeon, Wegrowski, Bontemps y Maquart J Invest Dermatol 2000 Dec115 (6): 962-968
Se estudiaron los eventos de cicatrización de heridas en "cámaras de heridas" en ratas. Un estudio de los efectos de GHK-Cu in vivo, utilizando el modelo de cámara de heridas de rata. Las heridas de rata tratadas con GHK-Cu tuvieron un aumento dependiente de la concentración de peso seco, ADN, proteína total, colágeno y glicosaminoglicano. La estimulación de la síntesis de colágeno fue el doble que la de las proteínas no colágenas. Se incrementaron los ARNm de colágeno tipo I y tipo III. También se encontró un aumento de la cantidad relativa de dermatán sulfato. Estimulación in vivo de la acumulación de tejido conectivo por el complejo tripéptido-cobre glicil-L-histidil-L-lisina-Cu2 + en heridas experimentales de rata. Maquart, Bellon, Chaqour, Wegrowski, Monboisse, Chastang, Birembaut y Gillery (Universidad de Reims, Francia) J Clin Invest 92: 2368-76, 1993
Metaloproteinasas que eliminan las proteínas dañadas y el tejido cicatricial. Las metaloproteinasas son una familia de proteínas que eliminan las proteínas dañadas y el tejido cicatricial. Se investigó la expresión y activación de metaloproteinasas de matriz en un modelo de heridas experimentales en ratas y su modulación por GHK-Cu. Las cámaras de la herida se insertaron debajo de la piel de las ratas y se inyectaron diariamente con inyecciones de 2 mg de GHK-Cu o el mismo volumen de solución salina. El fluido de la herida y el tejido conectivo neosintetizado depositado en las cámaras se recogieron y analizaron para determinar la expresión y / o actividad de la metaloproteinasa de la matriz. La colagenasa intersticial aumentó en el líquido de la herida durante todo el experimento y GHK-Cu no alteró su actividad. La metaloproteinasa de matriz-9 (gelatinasa B) y la metaloproteinasa de matriz-2 (gelatinasa A) fueron las dos principales actividades gelatinolíticas expresadas durante el proceso de curación. La metaloproteinasa-9 de pro-matriz se expresó fuertemente durante las primeras etapas de la cicatrización de heridas (día 3) pero disminuyó rápidamente mientras que en las cámaras tratadas con GHK-Cu persistió hasta el día 22. La metaloproteinasa-2 de pro-matriz aumentó progresivamente hasta el día 7, luego disminuyó hasta el día 18. La metaloproteinasa-2 de matriz activada aumentó hasta el día 12, luego disminuyó progresivamente mientras que GHK-Cu aumentó la metaloproteinasa-2 de la pro-matriz y la metaloproteinasa-2 de matriz activada durante las últimas etapas de curación. GHK-Cu aumentó la actividad de las metaloproteinasas hasta 4 veces, lo que puede aumentar la actividad de los procesos de remodelación de heridas que eliminan las proteínas dañadas y el tejido cicatricial. Expresión y activación de metaloproteinasas de matriz en heridas: modulación por el complejo tripéptido-cobre glicil-L-histidil-L-lisina-Cu2 +, Simeon Monier Emonard Gillery Birembaut, Hornebeck y Maquart (Faculte de Medecine, Reims, Francia) J Invest Dermatol 1999 112 (6): 957-64
Metaloproteinasas y antiproteinasas - commen t GHK-Cu aumenta MMP-2 en fibroblastos cultivados pero en heridas de rata disminuye MMP-2 y MMP-9. GHK-Cu también aumenta los inhibidores de metaloproteinasas TIMP-1 y TIMP-2 en fibroblastos cultivados. Las acciones generales parecerían reducir la proteólisis pero quizás mantenerla a un nivel más bajo que en las heridas en etapa temprana.
Metaloproteinasas y antiproteinasas que remodelan los tejidos El efecto de GHK-Cu sobre la inducción de metaloproteinasas en fibroblastos de heridas cultivadas. GHK-Cu a 10exp (-10) M aumentó el ARNm de MMP-2 y también inhibidores de metaloproteinasas TIMP-1 y TIMP-2. Los autores argumentan que esto indica que GHK-Cu modula la remodelación tisular. El complejo tripéptido-cobre GHK-Cu estimula la expresión de las metaloproteinasas 2 de la matriz mediante cultivos de fibroblastos. Simeon, Emonard, Hornebeck & amp Maquart Laboratoire de Biochimie-UPRESA CNRS 6021, Faculte de Medecine, Reims, Francia. Life Sci 2000 septiembre 2267 (18): 2257-65
Metaloproteinasas y antiproteinasas que remodelan los tejidos GHK-Cu provocó una disminución significativa en el área de la herida (64,5% GHK-Cu frente al 28,2% de control) el día 13. GHK-Cu también redujo significativamente las concentraciones de TNF-alfa y MMP-2 y MMP-9. Canapp SO Jr, Farese JP, Schultz GS, Gowda S, Ishak A.M, Swaim SF, Vangilder J, Lee-Ambrose L, Martin FG, El efecto del complejo de cobre-tripéptido tópico en la curación de heridas abiertas isquémicas, Vet Surg. 2003 noviembre-diciembre 32 (6): 515-23
La glicil-histidil-lisina interactúa con el receptor AT1 de angiotensina II. García-Sainz JA, Olivares-Reyes JA. Departamento de Bioenergética, Universidad Nacional Autónoma de México, México D. F. Peptides 199516 (7): 1203-7
Revisión de la regeneración de tejidos de péptidos de cobre - Año 2000 Resumen de resultados biológicos y clínicos. Enlace al resumen de la charla Praga, República Checa, 19 de mayo de 2000
GHK es una matrikine que estimula la remodelación tisular Se ha propuesto el término "matrikina" para designar tales péptidos derivados de ECM capaces de regular la actividad celular. GHK es una matrikina y un potente activador de la síntesis y remodelación de ECM Regulation de l'activite cellulaire par la matrice extracelulaire: le concept de matrikines. Maquart FX Simeon A Pasco S Monboisse JC. J Soc Biol 1999193 (4-5): 423-8
GHK-Cu y reducción de la formación de cicatrices queloides Se probaron los efectos de GHK-Cu sobre la producción de la hormona productora de queloides TGF-beta1 por parte de fibroblastos normales y productores de queloides. GHK-Cu, a 10exp (-9) M redujo la producción de TGF-beta1 en fibroblastos tanto normales como productores de queloides. Por el contrario, el ácido retinoico (Retin-A, Tretinoína) aumenta la producción de cicatriz que produce TGF-beta1 en estas líneas. El efecto del tripéptido de cobre y la tretinoína sobre la producción del factor de crecimiento en un modelo de fibroblasto libre de suero. McCormack, M., Nowak KC, Koch, J. Arch Facial Plast Surg 2001 3: 28-32
Revisión de la regeneración de tejidos de péptidos de cobre - Año 2002 Resumen de resultados biológicos y clínicos Pickart, L. Péptidos de cobre para la regeneración de tejidos. Specialty Chemicals, 9 de octubre de 2002, 29-31.

Estimulación del crecimiento de las uñas

Durante los períodos de lluvia prolongados en el estado de Washington, los caballos a menudo desarrollan irritaciones severas en sus extremidades inferiores y ndash, especialmente donde la piel cubierta de pelo se une a los cascos. Esta zona de la piel puede desarrollar irritaciones, infecciones y sangrado. Durante los experimentos para curar la piel tan irritada con cremas que contienen péptidos de cobre, la aplicación de la crema de péptido de cobre fue a menudo imprecisa debido a los movimientos de los caballos y la crema se aplicó generosamente en la piel inferior de la pierna y parte de los cascos superiores. Si bien se observó que las cremas curaban rápidamente las áreas de la piel, también observamos inesperadamente que las pezuñas dañadas parecían mejorar notablemente su salud. Más tarde, experimentamos con una aplicación más controlada de las cremas de péptidos de cobre en las grietas de los cascos muy dañados. Descubrimos que la crema de péptido de cobre generalmente producía una curación notable de los cascos y el cierre de las grietas.

Dado que los cascos de los caballos y las uñas de los humanos son similares en términos de su bioquímica y biología celular, probamos la aplicación de tales cremas de péptidos de cobre en las uñas de las manos y los pies de las personas dañadas. Observamos que dicho tratamiento produjo en humanos, como en caballos, una mejora notable en la salud y el crecimiento de las uñas. Estos tipos de péptidos de cobre, cuando se aplican a la matriz de la uña y al área del lecho de la uña, mejoran el proceso de crecimiento de la uña, lo que resulta en uñas más fuertes, gruesas y suaves. Se ha descubierto previamente que tales tipos de péptidos de cobre mejoran fuertemente la producción de la proteína colágeno y también aceleran la reparación de la piel dañada. Sin embargo, dado que las uñas se componen principalmente de la proteína dura queratina, no se esperaba que los péptidos de cobre aumentaran la producción de queratina y el crecimiento de las uñas.

Luego, estudiamos las acciones de una crema de péptido de cobre en un estudio piloto informal sobre el crecimiento de las uñas en humanos. Las uñas Placebo Control se trataron con una crema similar que no contenía péptido de cobre. Para los experimentos de prueba, se utilizaron como medida las tasas de crecimiento de las uñas del dedo índice. En la primera serie de experimentos, el péptido de cobre se aplicó a la uña índice y la cutícula de la mano derecha, mientras que la uña de la mano izquierda no se trató y se usó como control. En la segunda serie de experimentos con diferentes voluntarios, la crema se aplicó en la uña índice y la cutícula de la mano izquierda mientras que la uña de la derecha se trató con la crema placebo y se usó como control. Las uñas se trataron durante cuatro semanas. La longitud de la uña se midió desde el extremo del lecho ungueal hasta la punta de la uña en su centro empujando una pequeña regla de plástico debajo de la uña y firmemente contra el lecho ungueal. Las uñas también se inspeccionaron visualmente para determinar que las uñas tratadas parecían ser más largas en la mano tratada y esto fue fácilmente evidente en todos los casos. El efecto de la estimulación del crecimiento de las uñas fue aproximadamente similar si se usaba el grupo tratado con la mano derecha o el grupo tratado con la mano izquierda. Como se ve en la Tabla 1, las uñas tratadas con el complejo péptido-cobre tuvieron un mejor crecimiento de la uña. Sin embargo, se debe enfatizar que este no fue un estudio ciego.

Tabla 1 - Efecto del producto peptídico de cobre sobre el crecimiento de las uñas
Primer experimento (sexo: M o F) Crecimiento de las uñas de los dedos con crema de péptidos de cobre
(Milímetros en cuatro semanas)
Crecimiento de las uñas de los dedos con crema Placebo
(Milímetros en cuatro semanas)
Mano derecha Mano izquierda
Persona 1M 4.2 2.7
Persona 2M 3.2 2.1
Persona 3F 4.3 3.2
Persona 4F 3.8 2.9
Persona 5F 3.9 2.6
Segunda mano izquierda del experimento Mano derecha
Persona 6M 2.8 1.5
Persona 7M 3.7 2.6
Persona 8F 4.1 3.0
Persona 9F 4.1 2.6
Persona 10F 3.5 2.2

Mejora el bronceado y reduce la descamación de la piel

Esta patente contiene métodos para aumentar la eficiencia de la formación de melanina y reducir el daño por peeling posterior al bronceado. Disminuir el tiempo de exposición a la luz solar y el peeling posterior al bronceado reduciría la exposición general a los rayos ultravioleta.

Todo el enfoque del bronceado y la protección solar está en un estado de cambio. Muchos protectores solares químicos están prohibidos debido a sus acciones estrogénicas y otras toxicidades. La combinación de cremas reparadoras de la piel más reflectores ultravioleta como el óxido de zinc o el dióxido de titanio puede ser un mejor enfoque para la protección solar.

Tabla 9. Mejora del bronceado y reducción del daño de los rayos ultravioleta a las células de la piel

Métodos de bronceado mejorados Composiciones y métodos para el bronceado y la protección de la piel. Patente de Estados Unidos 5.698.184 Pickart
Bloquea el daño letal por radiación ultravioleta e inhibe la glicación dañina GHK bloquea el daño letal por radiación ultravioleta a los queratinocitos cutáneos cultivados al unir e inactivar especies de carbonilo reactivas como 4-hidroxinoneal, acroleína, malondialdehído y glioxal. Vea las microfotografías a continuación, que son cortesía de Lipotec Corporation (www.lipotec.com). Esta protección se encontró a un nivel relativamente alto de GHK, 20 mg / ml o 0,2%, pero esta concentración se puede agregar fácilmente a los filtros solares protectores. Los protectores solares actuales se construyen alrededor de moléculas, como oxibenzona, avobenceno, antranilato de mentilo, metoxicinamato de octilo, que absorben fuertemente la radiación ultravioleta y luego desprenden la energía liberándola en forma de radicales libres. Estos químicos que absorben radicales libres previenen las quemaduras solares, pero muchos de estos químicos tienen fuertes actividades estrogénicas y existe preocupación por su acumulación en los tejidos humanos. GHK también inhibe la glicación dañina del cobre, superóxido dismutasa de zinc causada por la fructosa. GHK es más activo que la carnosina a este respecto. J. Cebrian, A. Messeguer, R.M. Facino y J.M. García-Anton, Inter. J. Cosm. Sci. 27, 271-278 (2005)

Radiación UVB + HNE (4-Hydroxynonenal)

GHK + UVB + HNE (4-hidroxinonenal)

GHK-Cu surgió durante mis intentos de revertir ciertos cambios que ocurren durante el envejecimiento humano. El objetivo era suprimir la síntesis de fibrinógeno sanguíneo, una proteína que aumenta con la edad y aumenta aún más después de un infarto de miocardio. Su concentración sanguínea es un excelente predictor de mortalidad. Los niveles elevados de fibrinógeno aumentan la coagulación sanguínea y disminuyen la perfusión tisular, al aumentar las propiedades tixotrópicas de la sangre en la microcirculación.

Descubrí que la fracción de albúmina del plasma sanguíneo humano tiene una acción supresora sobre la síntesis de fibrinógeno y también mejoró la supervivencia de las células hepáticas cultivadas que producen fibrinógeno. Otros aislamientos encontraron estas actividades concentradas en una fracción de bajo peso molecular que contenía GHK-Cu. El trabajo posterior definió la estructura de solución tridimensional de GHK-Cu y las afinidades de unión entre GHK y cobre (II). Mis colegas de la Universidad de Washington (Seattle) y yo usamos la estructura de GHK-Cu para crear análogos que eran inhibidores del crecimiento celular muy potentes, inhibiendo la replicación de fibroblastos en concentraciones equivalentes a los fármacos quimioterapéuticos como cisplatino y bleomicina. Durante los procedimientos quirúrgicos para probar estos inhibidores sobre la supresión del crecimiento tumoral en ratones, se usó GHK-Cu como sustancia de control. Se hizo evidente que GHK-Cu curaba rápidamente las incisiones quirúrgicas.

Investigaciones posteriores encontraron que Iamin se genera durante el daño tisular y sugiere que, después del daño tisular, GHK-Cu sirve como una señal de retroalimentación humana que tiene potentes propiedades protectoras del tejido y estimula la remodelación del tejido después de la fase inicial de curación de la herida. Se postula que una generación localizada de GHK-Cu después de un daño tisular provoca un influjo de células de reparación de la piel llamadas macrófagos que inician los mecanismos de reparación de la piel. La disminución de las concentraciones sanguíneas de GHK-Cu durante el envejecimiento humano puede ser un factor en la disminución de la reparación tisular y el consiguiente aumento de la insuficiencia orgánica que se produce durante el envejecimiento.

GHK-Cu - Función en el cuerpo humano

Se han utilizado varios nombres en la literatura científica para GHK.

Nombres e identificaciones utilizados para GHK
Nombre sistemático N (2) - (N-glicil-L-histidil) -L-lisina
Número de registro CAS 49557-75-7
Fórmula molecular C14-H24-N6-O4
Nombre general Glicil-histidil-lisina
Sinónimos Cobre glicil-histidil-lisina
Cobre (II) ghk
Glicilhistidilisina
Gly-his-lys
Estoy en
NSC 379527
Prezatide (o Prezatide Copper como complejo)

¿Cuál es la función de GHK-Cu en el cuerpo humano? La molécula está presente en plasma sanguíneo, saliva y orina en cantidades fisiológicamente activas. La evidencia sugiere que es una señal de retroalimentación bioquímica que se genera después de una lesión tisular. Parece tener dos funciones principales: (1) primero como un potente agente antiinflamatorio y protector tisular que limita el daño oxidativo después de una lesión tisular, y (2) como una señal que activa la remodelación tisular, es decir, los procesos para la eliminación de proteína dañada y tejido cicatricial y su sustitución por tejido normal. Por lo tanto, GHK-Cu vincula los procesos de eliminación de tejido cicatricial dañado y deposición de tejido nuevo.

El GHK, que se genera en los tejidos dañados, acelera directamente muchas propiedades asociadas a la curación en concentraciones de alrededor de 10exp (-10) M. Algunos de los efectos estimulados por GHK parecen estar mediados directamente por GHK o GHK-Cu después de obtener cobre (II) de la albúmina. Es probable que otras acciones de GHK y GHK-Cu surjan de la atracción de GHK-Cu de macrófagos de heridas y otras células inmunes asociadas a la curación que, a su vez, liberan familias de proteínas de factores de crecimiento apropiadas para la reparación del tejido dañado.

Francois Maquart y sus colegas de Reims han argumentado que GHK-Cu actúa en la segunda fase de la curación como inductor de los procesos de remodelación tisular.Un apoyo adicional para este concepto es que el peso molecular de los fragmentos de colágeno inducidos por GHK-Cu son mucho más pequeños que los producidos en la fase inicial de la reparación de heridas. Esto sugiere que, con el complejo de cobre, la síntesis y degradación del colágeno ocurren simultáneamente. Además, en cultivo celular, GHK-Cu reduce la secreción de la proteína productora de cicatrices, TGF-beta-1, por fibroblastos normales y fibroblastos productores de queloides. Esto, combinado con las actividades curativas de GHK-Cu, sugiere que la curación sin cicatrices necesita tanto una activación de metaloproteinasas como una reducción en la producción de TGF-beta-1.

Mecanismo propuesto Acciones de cobre-péptido GHK-Cu después de una lesión tisular

La información de una variedad de fuentes nos permite proponer un mecanismo para los efectos GHK-Cu. La secuencia de eventos de los efectos inducidos por GHK-Cu parece ser la siguiente:

1. Inicialmente, después del daño tisular, se activa la primera etapa de los procesos de cicatrización de heridas. Estos incluyen coagulación sanguínea localizada, una invasión temprana de neutrófilos que secreta radicales de oxígeno esterilizantes, y luego una inducción por factores de crecimiento, como TGF-beta-1, de grandes cantidades de colágeno formador de cicatrices para formar una cubierta protectora sobre la lesión.

2. Una segunda etapa de curación comienza a activarse cuando las células alteradas liberan proteasas que generan una población de péptidos que incluyen Gly-His-Lys e His-Gly-His-Lys, los cuales tienen una afinidad muy alta por el cobre (+ 2) ion.

3. Gly-His-Lys y His-Gly-His-Lys comienzan a acumular iones de cobre (+2) de la albúmina y forman GHK-Cu y HGHK-Cu.

4. La acumulación de iones de cobre unidos a péptidos produce múltiples efectos antiinflamatorios que ayudan a detener la acción de esterilizar los radicales de oxígeno y permiten el inicio de eventos de curación. GHK-Cu bloquea los canales de ferritina y la liberación de hierro libre (oxidativo), bloqueando así la peroxidación lipídica catalizada por hierro que se produce después de una lesión. El GHK-Cu también bloquea el daño de la interleucina-1 a las células de los tejidos.

5. El GHK-Cu liberado en el torrente sanguíneo aumenta la producción corporal y la concentración sanguínea circulante de macrófagos de heridas que mejoran la reparación.

6. GHK-Cu suprime la síntesis del desarrollo de cicatrices al reprimir la producción de fibroblastos de TGF-beta-1.

7. GHK-Cu también quimioatrae los macrófagos de la herida al área de la herida. Estos macrófagos actúan directamente para estimular la curación al eliminar los desechos celulares y secretar una familia de aproximadamente 20 proteínas de factores de crecimiento.

8. GHK-Cu actúa directamente sobre los fibroblastos para estimular los ARNm del colágeno, elastina, proteoglicanos, metaloproteinasas y TIMP-1 y TIMP-2. Esto, a su vez, eleva los niveles de estas proteínas. Esto da como resultado una condición en la que la síntesis y el depósito de proteínas se producen de forma concomitante con la degradación de las proteínas que elimina el tejido cicatricial y los restos celulares que quedan de la alteración del tejido. Por lo tanto, GHK-Cu vincula la reducción de cicatrices y la reconstrucción de tejidos.

9. GHK-Cu induce la angiogénesis sirviendo como quimioatrayente para dirigir nuevos capilares sanguíneos al área de la herida e induciendo la producción de varias proteínas esenciales para la angiogénesis.

10. GHK-Cu induce el crecimiento neuronal y la reinervación de los tejidos dañados.

11. Este mecanismo de reparación tisular inducida por péptidos de cobre parece funcionar para la piel, los folículos pilosos, el revestimiento del estómago, el revestimiento intestinal, el tejido óseo y las pezuñas y las uñas de las manos.

12. Este mecanismo de regeneración de péptido de cobre es diferente de la mayoría de los patrones de respuesta hormonal bioquímica conocidos, como el sistema insulina-glucosa o el sistema eritropoyetina-glóbulos rojos. Con estos sistemas, un pequeño cambio en las concentraciones de glucosa o glóbulos rojos da como resultado una liberación controlada con precisión de las hormonas para restablecer los niveles normales de glucosa o glóbulos rojos.

13. La remodelación tisular del péptido de cobre es un sistema de respuesta al estímulo mucho más flexible, algo así como una respuesta de "lógica difusa". El daño tisular traumático es un asunto intrínsecamente complicado: los daños pueden ser leves o masivos. Los sistemas de reparación corporal no siempre reciben información rápida y clara sobre la extensión del daño tisular (los daños pueden ser repentinos y agudos) o el resultado de una enfermedad degenerativa lenta. Esto puede explicar por qué las cicatrices y lesiones dérmicas duran tanto en los adultos que el cuerpo simplemente no reconoce la necesidad de eliminar las imperfecciones.

La necesidad de péptidos de cobre mejorados para la regeneración de la piel

Los productos de primera generación diseñados en torno a GHK-Copper funcionaron bien en muchas pruebas controladas, sin embargo, los productos fallaron en los ensayos clínicos de la FDA sobre la curación de heridas humanas muy difíciles de curar (al igual que muchos otros enfoques). La fragilidad y la rápida degradación de GHK y péptidos similares es el principal problema en el desarrollo de productos para uso clínico y cosmético. En el cuerpo humano, el complejo GHK-Cu se puede generar constantemente. Sin embargo, cuando se usa como terapia de dosis única, su fragilidad conduce a una rápida degradación, eliminación de la dermis y pérdida de efectividad.

En 1975, durante los intentos de aislar la GHK de la sangre humana, descubrimos que la molécula era especialmente vulnerable a las carboxipeptidasas y se degradaba rápidamente por las enzimas sanguíneas. Las inyecciones intradérmicas de GHK se eliminan de la piel en aproximadamente 30 segundos. Si se agrega a la sangre, la GHK se degrada rápidamente en aminoácidos constituyentes por las enzimas sanguíneas. Endo, Miyagi y Ujie también informaron que GHK se degradaba rápidamente por el plasma sanguíneo y se eliminaba rápidamente de las ratas. (Referencia, Endo, Miyagi y Ujie, Kissei Pharmaceutical Co., Determinación simultánea de glicil-L-histidil-L-lisina y su metabolito, L-histidil-L-lisina, en plasma de rata mediante cromatografía líquida de alta resolución con post - derivatización de columna. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Apr 25692 (1): 37-42)

Esta fragilidad y rápida descomposición de GHK y otros complejos de péptidos de cobre simples es el principal problema en el desarrollo de productos para uso clínico y cosmético. En el cuerpo humano, el complejo GHK-Cu se puede generar constantemente. Sin embargo, cuando se usa como terapia de dosis única, su fragilidad conduce a una rápida degradación, eliminación de la dermis y pérdida de efectividad. Una variedad de modificaciones químicas de GHK han producido complejos de cobre bioactivos con mayor resistencia a la descomposición. El problema con este enfoque de la química orgánica clásica es que cada nueva sustancia química se convierte, en términos regulatorios de la FDA, en una nueva entidad química. Esto aumenta la posibilidad de efectos secundarios indeseables y aprobaciones regulatorias mucho más lentas.

Desarrollo actual de péptidos de cobre mejorados

Actualmente se han desarrollado péptidos de cobre más eficaces con acciones regenerativas de tejidos. Se evaluaron varios cientos de complejos de cobre-péptido, pero ninguno fue significativamente mejor que GHK-Cu. Algunos complejos, como f-Met-Leu-Phe-Cu, en realidad produjeron más formación de cicatrices. Los principales defectos de los péptidos individuales fueron la falta de estabilidad y la mala adherencia a la superficie de la piel.

Luego probamos las fracciones de péptidos que quedan después de la digestión enzimática de varias proteínas. Estos péptidos, que son los productos finales de la digestión enzimática, demostraron ser muy resistentes a una digestión enzimática adicional. Pruebas adicionales encontraron que los péptidos más prometedores eran una fracción de fragmentos de péptidos que quedaban después de la proteólisis parcial de proteínas de soja. Dichos péptidos de soja tienen una antigencidad muy baja y una larga historia de uso seguro en productos cosméticos y en soluciones utilizadas clínicamente para la alimentación intravenosa. Para aumentar la adherencia a la piel se utilizó una fracción peptídica con un porcentaje significativo de residuos de azúcar. Los digeridos de péptidos con azúcares adheridos tienen propiedades similares a las de la mucosidad y los fragmentos de péptidos de colágeno se han utilizado como colas, como las colas "Le Pages" que alguna vez usaron los escolares. Esto ayuda a adherir los componentes activos de la crema a la piel o a las heridas húmedas.

En la década de 1930 se utilizaron digestiones de proteínas de péptidos mixtos similares para atraer y concentrar macrófagos de heridas. La digestión se inyectó intraperitonealmente en ratas y 24 horas después los macrófagos se concentraron en la cavidad intraperitoneal y se recolectaron.

Cuando el cobre (II) se quela a esta fracción de péptidos, esto produce péptidos de cobre con propiedades reparadoras de la piel muy fuertes. En estudios con personas con alergia al níquel, también se encontró que estos péptidos de cobre tienen fuertes acciones antiinflamatorias, aproximadamente iguales a las observadas para la cortisona. Debido a su resistencia a la degradación, estos péptidos de cobre se pueden usar con hidroxiácidos exfoliantes de la piel para una renovación más rápida de la piel y para la reducción de cicatrices. Estos péptidos tienen una potencia mejorada, resistencia a la degradación, una duración de acción más prolongada y una adherencia muy alta a la piel.

En estudios veterinarios, las cremas elaboradas a partir de estos nuevos complejos de cobre produjeron una curación rápida y sin cicatrices en los perros después de las operaciones de esterilización y en los caballos jóvenes después de las operaciones de enderezamiento de las patas. Esto permitió que los perros fueran devueltos a sus dueños en cuatro días en lugar de los cinco habituales, mientras que los potros fueron devueltos en cinco días en lugar de siete. En humanos, cuatro pequeños estudios controlados con placebo encontraron una curación de la piel más rápida después de las lesiones cutáneas inducidas por el desprendimiento de la cinta adhesiva, las quemaduras con acetona (eliminación de los lípidos de la piel), la irritación del detergente durante 24 horas y la inflamación por alergia al níquel.

Síntesis química frente a métodos biológicos para la creación de péptidos de cobre de acción prolongada

Se reemplazó el residuo de histidina con un aminoácido sintético, L-espinacina o ácido L-1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxílico. Investigados con potenciometría, calorimetría en solución, espectrofotometría UV-VIS, dicroísmo circular y espectroscopias de resonancia paramagnética electrónica. Todos los ligandos formaron complejos de cobre con diferentes estequiometrías y estabilidades.

Después de 3 horas en suero, la GHK se degradó pero los compuestos sintéticos no mostraron una degradación significativa.

Método para desarrollar péptidos de cobre de acción prolongada Resultado Problemas potenciales Referencia
Síntesis química. Se sintetizó un análogo parcialmente retro-inverso de GHK, en el que el enlace -CONH- entre histidina y lisina se modificó como -NHCO-. El nuevo péptido análogo mostró aproximadamente un aumento de diez veces en la estabilidad frente al péptido original. Esta es una nueva entidad química - Requeriría extensas pruebas de seguridad. Puede perder actividad antiinflamatoria. H-Gly-His psi (NHCO) Lys-OH, análogo retro-inverso parcialmente modificado del factor de crecimiento glicil-L-histidil-L-lisina con estabilidad enzimática mejorada. Dalpozzo A, Kanai K, Kereszturi G, Calabrese G. Int J Pept Protein Res 1993 Jun41 (6): 561-6
Síntesis química. GHK sintéticamente modificado con grupos resistentes a la degradación - Se trata de nuevas entidades químicas: requerirían pruebas de seguridad exhaustivas. Puede perder actividad antiinflamatoria. Complejos de cobre de glicil-histidil-lisina y dos de sus análogos sintéticos: comportamiento químico y actividad biológica, Conato et al, Biochim Biophys Acta 1526, 199-210, 2001
Síntesis biológica. Utilice una fracción de digestión enzimática de proteína de soja: estos péptidos de resultado final son resistentes a una mayor degradación enzimática. Después de 3 horas en suero, los complejos de cobre de la digestión de soja retuvieron la cicatrización de heridas y las actividades antiinflamatorias en comparación con el suero nativo. Ninguno encontrado: pasó todas las pruebas de seguridad. Estos tipos de péptidos se han utilizado ampliamente para la alimentación intravenosa, en complementos alimenticios y en champús y acondicionadores. Pickart Patente de Estados Unidos 5.382.431 Composiciones de protección y regeneración de tejidos Patente de Estados Unidos 5.554.375 Composiciones de protección y regeneración de tejidos Patente de Estados Unidos 5.698.184 Composiciones y métodos para el bronceado y protección de la piel Patente de Estados Unidos 5.888.522 Composiciones de protección y regeneración de tejidos.

Howard Maibach dirigió cuatro estudios sobre la reparación de la piel humana utilizando estos péptidos de cobre resistentes a la degradación formulados en una base de crema no iónica. Estos estudios doble ciego controlados con placebo dieron resultados positivos estadísticamente significativos de que las cremas de péptido de cobre aceleraron notablemente la tasa de recuperación de la piel y redujeron la irritación después de un daño cutáneo severo. Los estudios incluyeron (1) La piel dañada con acetona ha eliminado las grasas de la piel y produce un daño similar a una piel muy seca y agrietada, (2) La piel dañada por detergente tiene muchas grasas eliminadas y un daño extenso en la capa exterior de las proteínas de la barrera cutánea. . Esta es la prueba estándar para la dermatitis de contacto. (3) La piel dañada por alergia al níquel se produce mediante la aplicación de sales de níquel en la piel de pacientes sensibilizados. Esto es similar al daño de la piel causado por otras respuestas alérgicas como la hiedra venenosa, el roble venenoso y otros alérgenos, y (4) la piel pelada con cinta adhesiva, que es similar a los restos dañinos, las abrasiones y los pequeños cortes en la superficie de la piel. Se coloca una tira de cinta adhesiva en la piel y luego se arranca rápidamente. Este proceso se repite unas 50 veces en el mismo lugar, produciendo finalmente una pequeña herida en la piel.


Los péptidos de cobre mixtos utilizan un enfoque diferente al método GHK-Cu de molécula única. La digestión contiene millones de complejos de iones de cobre de péptidos variantes, más parecido a la situación que surge después del daño tisular y la proteólisis posterior. El mecanismo fisiológico por el cual la piel u otros órganos señalan la reparación es bastante complejo. Sin embargo, para uso terapéutico, un enfoque mucho más simple a menudo es suficiente para inducir la regeneración tisular. In vivo, los péptidos activos deben tener una afinidad muy alta por el cobre (+2) para obtener iones de cobre y formar complejos de péptidos de cobre. Pero exógenamente, podemos fácilmente complejar mezclas de péptidos, incluso con una afinidad mucho menor por el ión de cobre, con cobre (+2) simplemente agregando sales de cobre a una solución de los péptidos. La razón científica para la bioactividad de tales péptidos de cobre es que Numerosos fragmentos de péptidos son generados por enzimas proteolíticas. Una fracción de estos péptidos tendrá una alta afinidad por el cobre (+2) y una parte puede tener propiedades similares a GHK-Cu.

Comparación de atributos de GHK y HGHK frente a digestiones de proteínas enzimáticas
Parámetro biológico GHK y HGHK Nuevos digeridos de proteínas enzimáticas
Quimioatracción de macrófagos de heridas: muy alta Elevado
Afinidad de unión al cobre: ​​muy alta Moderado, debe agregar iones de cobre a la mezcla
Antigenicidad: ninguna Ninguno en el tipo que se usa actualmente / Pruebas de antigenicidad humana aprobadas y pruebas con animales
Actividad curativa en modelos animales - Moderada Elevado
Adherencia a piel y heridas - Baja Muy alto, forma un "pegamento" biológico
Despeje del área aplicada - Rápido Lento

Importancia de la formulación cuidadosa de complejos peptídicos de cobre

Con las cremas de péptidos de cobre, se debe tener mucho cuidado para producir una crema que tenga interacciones mínimas con el cobre iónico de la crema. Los formuladores que preparan cremas para la piel generalmente tienen solo un conocimiento limitado de química y no saben prácticamente nada sobre biología celular, interacciones hormonales y bioquímica general. Es fácilmente posible producir cremas, lociones y soluciones que contienen cobre que neutralizan los efectos del péptido de cobre mediante la interacción de varios componentes con el cobre iónico. También es posible crear complejos de cobre que inhiban la replicación celular. Cabe destacar que el trabajo de GHK-Cu surgió de proyectos financiados por el Instituto Nacional del Cáncer para el desarrollo de análogos inhibidores del crecimiento de GHK-Cu. Durante este proyecto, se sintetizaron análogos de GHK-Cu que inhibían la replicación de fibroblastos a 10exp (-16) M. Algunas empresas han vendido recientemente productos cosméticos para la piel que utilizan EDTA-cobre, pero este complejo inhibe la función de los fibroblastos y la reparación de la piel. Cualquier producto debe probarse cuidadosamente para determinar su efecto sobre la reparación de la piel.

Para los estudios de péptidos de cobre, formulamos una crema no iónica pero estable. Para la conservación de la crema, se utilizó Germaben II, que según nuestras pruebas no influyó en el proceso de reparación de heridas. Este producto contiene diazolinidinil urea, metilparabeno y propilparabeno y produce cremas autoesterilizantes con excelente conservación durante al menos cuatro años a temperatura ambiente. Un inconveniente del sistema conservante es que algunas personas están sensibilizadas a los parabenos, pero no existe un conservante perfecto para los productos de cicatrización de heridas. El alcohol benzoílico nunca debe usarse como conservante para productos de cicatrización de heridas, ya que inhibe la replicación de los fibroblastos de heridas.

Supresión de GHK de genes de metástasis de cáncer, decorina y análogos inhibidores del crecimiento de la región de unión de cobre de GHK

La GHK suprime los genes de metástasis del cáncer humano, pero debido al sistema de cultivo celular utilizado, es probable que la GHK se haya convertido en GHK-cobre. El GHK-cobre también aumenta la proteína Decorina (llamada así porque "decora" las hebras de colágeno). Decorin tiene una desconcertante mezcla de efectos: regeneración de músculos y nervios, reducción de cicatrices e inhibición del crecimiento tumoral y metástasis del cáncer en animales.

Supresión de GHL de metástasis de cáncer

Los autores buscaron sustancias que puedan revertir la expresión de los genes implicados en la metástasis del cáncer de colon humano.

Para determinar la expresión génica de células humanas normales y cancerosas, midieron el ARN producido por las células. Para encontrar sustancias que puedan revertir la expresión de los genes involucrados en la metástasis, utilizaron una base de datos muy confiable desarrollada en el Instituto Broad (Instituto Tecnológico de Massachusetts y Harvard) de 7000 perfiles de expresión de todo el genoma después del tratamiento de 4 líneas celulares humanas con 1309 sustancias bioactivas. Solo dos sustancias, GHK y securenine (un alcaloide) de la elección de 1309 pudieron silenciar los genes involucrados en la propagación del tumor. Los autores también mencionan la baja toxicidad de GHK y la baja concentración (1 micromolar) que produce el efecto deseado.

GHK suprime los genes de metástasis del cáncer humano

Clin Exp Metástasis. 27 de febrero de 2010 (2): 83-90. Epub 2010 9 de febrero.

Una firma `` propensa a la metástasis '' para pacientes con cáncer colorrectal esporádico competente en la reparación de desajustes en etapa temprana y sus implicaciones para posibles terapias.

Hong Y, Downey T, Eu KW, Koh PK, Cheah PY., Departamento de Cirugía Colorrectal, Hospital General de Singapur, Singapur, 169608, Singapur.

La metástasis es la principal causa de mortalidad por cáncer. Nuestro objetivo fue encontrar una firma propensa a la metástasis para pacientes con cáncer colorrectal esporádico (CCR) competente en la reparación de desajustes en etapa temprana para un mejor pronóstico y un uso informado de la quimioterapia adyuvante. Los perfiles de expresión de todo el genoma de 82 pacientes y controles sanos de la misma edad, etnia y tejido se analizaron utilizando la matriz Affymetrix U133 Plus 2. Los pacientes con metástasis negativa tienen un seguimiento de 5 años o más. Se utilizó un diseño de validación cruzada anidado de dos niveles de 10 x 10 con varias familias de modelos de clasificación para identificar el predictor óptimo de metástasis. El mejor modelo de clasificación produjo un conjunto de 54 genes (74 conjuntos de sondas) con una precisión de predicción estimada del 71%. La especificidad, sensibilidad, valores predictivos negativos y positivos de la firma son 0,88, 0,58, 0,84 y 0,65, respectivamente, lo que indica que el conjunto de genes puede mejorar el pronóstico de los pacientes con CCR esporádico en estadio temprano.Estos 54 genes, incluidas las moléculas de nodo YWHAB, MAP3K5, LMNA, APP, GNAQ, F3, NFATC2 y TGM2, integran múltiples funciones biológicas en varios compartimentos en una intrincada red molecular, lo que sugiere que las perturbaciones de toda la célula están involucradas en la transformación de metástasis. Además, consultar el 'Mapa de conectividad' con un subconjunto (70%) de estos genes muestra que Gly-His-Lys y la securinina podrían revertir las expresiones diferenciales de estos genes de manera significativa, lo que sugiere que tienen un efecto terapéutico combinatorio en los pacientes propensos a la metástasis. . Estos dos perturbagenos promueven la cicatrización de heridas, la remodelación de la matriz extracelular y la activación de los macrófagos, lo que resalta la importancia de estas vías en la supresión de metástasis para el CCR en estadio temprano.

GHK-cobre aumenta la decorina que suprime el crecimiento del cáncer y la metástasis

Las metástasis en el cáncer de mama son una preocupación vital en el tratamiento, con el receptor del factor de crecimiento epidérmico y ErbB2 fuertemente implicados en la mediación de la invasión y diseminación tumoral. En este estudio, investigamos el papel de la decorina en la supresión de carcinomas de mama primarios y metástasis pulmonares. Demostramos que la decorina causa una marcada supresión del crecimiento tanto in vitro como in vivo utilizando una línea celular de cáncer de mama metastásico y un modelo de carcinoma mamario ortotópico. El tratamiento con núcleo de proteína decorina redujo el crecimiento del tumor primario en un 70% y eliminó las metástasis observadas. Un vector adenoviral que contenía el transgén de decorina provocó un retraso del tumor primario del 70%, además de reducir en gran medida las metástasis observadas. Además, demostramos que la fosforilación de ErbB2 y los niveles de proteína receptora total se reducen en este sistema modelo tras la expresión de novo de decorina bajo el control de un promotor inducible por doxiciclina. El crecimiento del tumor primario in vivo se redujo hasta en un 67% tras la inducción de decorina, y también se obstaculizaron notablemente las metástasis pulmonares. Es probable que estos efectos se produzcan a través de la regulación a la baja a largo plazo de decorin de la cascada de tirosina quinasa ErbB2. Estos resultados demuestran un papel novedoso para la decorina en la reducción o prevención de metástasis tumorales en este modelo de cáncer de mama y podrían eventualmente conducir a terapias mejoradas para el cáncer de mama metastásico.

La decorina, un miembro de la pequeña familia de genes de proteoglicanos ricos en leucina, regula a la baja a los miembros de la familia de tirosina quinasas del receptor ErbB y atenúa su señalización, lo que conduce a la inhibición del crecimiento. Investigamos los efectos de la decorina sobre el crecimiento de células de carcinoma mamario que sobreexpresan ErbB2 en comparación con AG879, un inhibidor de la cinasa ErbB2 establecido. Los ensayos de proliferación celular y crecimiento independiente del anclaje mostraron que la decorina era un potente inhibidor del crecimiento de las células del cáncer de mama y un agente proapoptótico. Cuando se usaron decorina y AG879 en combinación, el efecto inhibidor fue sinérgico en los ensayos de proliferación, pero solo fue aditivo tanto en la formación de colonias como en los ensayos de apoptosis. El núcleo de proteína decorina humana recombinante activa, AG879, o una combinación de ambos, se administró sistémicamente a ratones que portaban xenoinjertos de carcinoma mamario ortotópico. Tanto la decorina como el AG879 redujeron el crecimiento y el metabolismo del tumor primario en aproximadamente un 50%. Sin embargo, no se observó sinergismo in vivo. La decorina se dirigió específicamente a las células tumorales y provocó una reducción significativa de los niveles de ErbB2 en los xenoinjertos tumorales. Lo que es más importante, la administración sistémica de decorina evitó la propagación metastásica a los pulmones, según se detectó mediante la detección de ADN específico de la nueva especie y los ensayos cuantitativos. Por el contrario, AG879 no tuvo ningún efecto. Nuestros datos respaldan el papel de la decorina como un agente terapéutico poderoso y eficaz contra el cáncer de mama debido a su inhibición tanto del crecimiento del tumor primario como de la diseminación metastásica.

La metástasis pulmonar es el evento más crucial que afecta el resultado terapéutico del osteosarcoma. Por tanto, la prevención de la metástasis pulmonar es importante para mejorar el pronóstico de los pacientes con osteosarcoma. La decorina es una de las principales proteínas de la matriz extracelular que se ha convertido en el foco de varios estudios sobre el cáncer. El papel biológico de la decorina en el osteosarcoma aún no se ha aclarado. El objetivo de este estudio fue examinar el potencial de la decorina como un nuevo objetivo biológico para el tratamiento del osteosarcoma. En este estudio, se utilizó la línea celular de osteosarcoma murino LM8 (LM8) con alto potencial metastásico al pulmón. Las dos líneas celulares establecidas fueron LM8-DCN que expresaron de manera estable decorina humana (hDCN) y LM8-mock, establecida como control. La línea celular LM8-DCN se inyectó por vía subcutánea en el lomo de los ratones. Se observaron significativamente menos metástasis pulmonares en ratones con LM8-DCN en comparación con ratones inoculados con LM8 y LM8-mock (P & lt0,001). Además, los ratones del grupo inoculado con LM8-DCN sobrevivieron significativamente más que los del grupo inoculado de forma simulada con LM8 y LM8, según el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y las pruebas de rango logarítmico (P & lt0,005). El efecto de la decorina sobre las tasas de crecimiento, la motilidad y la capacidad de invasión de LM8 se investigó in vitro. No hubo diferencia en la morfología ni en las tasas de crecimiento, pero la decorina inhibió la motilidad y la invasión de LM8. Estos resultados sugieren que la decorina tiene el potencial terapéutico para prevenir la metástasis pulmonar en el osteosarcoma.

Oncología. 200977 (2): 92-9. Epub 2009 7 de julio.
La decorina suprime la metástasis ósea en una línea celular de cáncer de mama.

Araki K, Wakabayashi H, Shintani K, Morikawa J, Matsumine A, Kusuzaki K, Sudo A, Uchida A. Departamento de Cirugía Ortopédica, Facultad de Medicina de la Universidad de Mie, Mie, Japón.

La decorina, el prototipo de una familia en expansión de pequeños proteoglicanos ricos en leucina, participa en una serie de procesos celulares que incluyen el ensamblaje de la matriz, la fibrilogénesis y el control de la proliferación celular. En este estudio, investigamos el papel de la decorina en la supresión de la agresividad tumoral y las metástasis óseas. Usamos una línea celular de cáncer de mama metastásico, MDA-MB-231, para mostrar que la decorina causa una marcada supresión del crecimiento tanto in vitro como in vivo. Un vector citomegaloviral que contenía el transgén de decorina provocó una gran reducción del crecimiento celular, la motilidad y las metástasis observadas. Las metástasis óseas se redujeron en & gt90% tras la transfección con decorina. Estos resultados demuestran un papel novedoso para la decorina en la reducción o prevención de metástasis tumorales en este modelo de cáncer de mama y eventualmente podrían conducir a terapias mejoradas para el cáncer de mama metastásico.

Las vías del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y del receptor de andrógenos (AR) juegan un papel fundamental en la progresión del cáncer de próstata. Por lo tanto, los agentes con capacidad de direccionamiento dual pueden tener un potencial terapéutico importante. Se sabe que la decorina, un proteoglicano presente en el microambiente del tumor, regula el ensamblaje de la matriz, la unión del factor de crecimiento y la actividad de la tirosina quinasa del receptor. Aquí, mostramos que en ratones Pten (P - / -) específicos de próstata, un modelo de ratón inmunocompetente genéticamente definido de cáncer de próstata, la administración sistémica de decorina inhibe la progresión tumoral al dirigirse a la proliferación celular y las vías de supervivencia. Además, en las células de cáncer de próstata humano, mostramos que la decorina inhibe específicamente la fosforilación de EGFR y AR y la diafonía entre estas vías. Esto previene la translocación nuclear AR e inhibe la producción de antígeno prostático específico. Además, la vía de supervivencia de las células fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K) / Akt se suprime, lo que conduce a la apoptosis de las células tumorales. Esos hallazgos destacan la efectividad de la decorina en presencia de un poderoso riesgo de cáncer genético e implican a la decorina como un nuevo agente potencial para la terapia del cáncer de próstata al dirigirse a las vías EGFR / AR-PI3K-Akt.

La decorina, el miembro prototipo de los pequeños proteoglicanos ricos en leucina, reside en el microambiente del tumor y afecta la biología de varios tipos de cáncer al regular negativamente la actividad de varios receptores implicados en el crecimiento y la supervivencia celular. La decorina se une y modula la señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico y otros miembros de la familia ErbB de receptores tirosina quinasas. Ejerce su actividad antitumoral mediante un mecanismo dual: mediante la inhibición de estos receptores clave a través de su regulación negativa física junto con la atenuación de su señalización, y mediante la unión y secuestro de TGFbeta. La decorina también modula el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina y la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad, que afecta indirectamente a la vía del receptor de TGFbeta. Cuando se expresa en ratones portadores de xenoinjertos tumorales o se inyecta sistémicamente, la decorina inhibe tanto el crecimiento del tumor primario como la diseminación metastásica. En esta revisión, resumimos los últimos informes sobre decorina y moléculas relacionadas que son relevantes para el cáncer y presentamos la idea de decorina como un marcador terapéutico contra el cáncer y posible pronóstico para pacientes afectados por varios tipos de tumores. También discutimos el papel de lumican y LRIG1, un nuevo inhibidor del crecimiento celular homólogo a la decorina.

P63 como inhibidor del cáncer

Existe alguna evidencia de que la proteína P63 también inhibe el crecimiento del cáncer.

Arch Dermatol Res. 2009 Abril 301 (4): 301-6. El cobre-GHK aumenta la expresión de integrinas y la positividad de p63 por parte de los queratinocitos. Kang YA, Choi HR, Na JI, Huh CH, Kim MJ, Youn SW, Kim KH, Park KC. Departamento de Dermatología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seúl, República de Corea.

El glicil-L-histidil-L-lisilo (GHK) posee una alta afinidad por los iones cobre (II), con los que forma espontáneamente un complejo (cobre-GHK). Es bien sabido que el cobre-GHK juega un papel fisiológico en el proceso de curación de heridas y reparación de tejidos estimulando la síntesis de colágeno en fibroblastos. Este estudio se realizó para investigar los efectos del cobre-GHK en los queratinocitos. Se analizaron los efectos proliferativos y se realizaron tinciones con hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica para evaluar los efectos del cobre-GHK en modelos de piel equivalente (EE). Además, se realizó una transferencia de Western. En los queratinocitos cultivados en monocapa, el cobre-GHK aumentó la proliferación de queratinocitos. Cuando se evaluaron los modelos SE, las células basales se volvieron cuboidales cuando se añadió cobre-GHK. El análisis inmunohistoquímico reveló que el cobre-GHK aumentó el antígeno nuclear celular proliferante (PCNA) y la positividad de p63. Además, la expresión de integrina alfa6 y beta1 aumentó en modelos SE, y estos resultados fueron confirmados por Western blot. Los resultados de este estudio indican que el tratamiento con cobre-GHK puede incrementar el potencial proliferativo de los queratinocitos basales al modular la expresión de integrinas, p63 y PCNA. Además, el aumento de los niveles de p63, un posible marcador de células madre de la piel, sugiere que el cobre-GHK promueve la supervivencia de las células madre basales en la piel.

Diferencia de muerte celular. 9 de abril de 2010 [Publicación electrónica antes de la impresión]

Proteínas de la familia p53 y sus reguladores: ejes y radios en la supresión de tumores.
Collavin L, Lunardi A, Del Sal G. Laboratorio Nazionale CIB (LNCIB), AREA Science Park, Trieste, Italia, Dipartimento di Scienze della Vita, Universit & agrave degli Studi di Trieste, Trieste, Italia.

Abstracto
El supresor de tumores p53 es un eje central en una red molecular que controla la proliferación celular y la muerte en respuesta a condiciones potencialmente oncogénicas, y una amplia gama de modificaciones covalentes e interacciones de proteínas modulan las actividades nucleares y citoplasmáticas de p53. Los parientes de p53, p73 y p63, están entrelazados en la misma red reguladora, estando sujetos al menos en parte a las mismas modificaciones e interacciones que transmiten señales en p53, y contribuyendo activamente a la salida celular resultante. El cuadro emergente es el de una vía interconectada, en la que todas las proteínas de la familia p53 están involucradas en la respuesta al estrés oncogénico y a los estímulos fisiológicos. Por lo tanto, los interactuantes comunes y específicos de las proteínas de la familia p53 pueden tener un efecto amplio sobre la función y disfunción de esta vía. Muchos años de investigación han descubierto una cantidad impresionante de proteínas que interactúan con p53, pero se sabe mucho menos sobre las interacciones de proteínas de p63 y p73. Sin embargo, muchos interactuantes pueden ser compartidos por múltiples proteínas de la familia p53, con efectos similares o diferentes. En este estudio revisamos los interactores compartidos de las proteínas de la familia p53 con el objetivo de fomentar la investigación en este campo.Este conocimiento promete revelar elementos reguladores que podrían ser atacados por una nueva generación de moléculas y permitir un uso más eficiente de los medicamentos actualmente disponibles para el cáncer. tratamiento.

Inhibición del crecimiento de células cultivadas y un fibrosarcoma implantado por análogos de aroilhidrazona del complejo Gly-His-Lys-Cu (II). Biochem Pharmacol 1983 Dec 1532 (24): 3868-71.

Pickart L, Goodwin WH, Burgua W, Murphy TB, Johnson DK, Biochem. Pharmacol., 32, 1983, 3868-71.

Las aroilhidrazonas de piridoxal y de salicilaldehído, una serie de agentes quelantes tridentados, son potentes inhibidores de la síntesis de ADN y el crecimiento celular en varias líneas celulares humanas y de roedores que crecen en cultivo. Un complejo de cobre (II) del más potente de los quelantes, salicilaldehído benzoil hidrazona (SBH), exhibe una actividad inhibidora significativamente mayor que la del propio SBH. Aunque las formas bioactivas y el mecanismo de acción de estos agentes son inciertos, su actividad citotóxica puede igualar o exceder la de muchos quelantes y quelatos que se sabía previamente que poseen tales propiedades, incluidos los compuestos usados ​​clínicamente. SBH y su complejo de cobre son relativamente no tóxicos para los ratones y muestran cierta selectividad en sus efectos sobre diferentes tipos de células. Es posible que las aroilhidrozonas de este tipo y / o sus complejos metálicos puedan resultar agentes terapéuticos útiles.

Los análogos de hidrazona de la región de unión al cobre GHK son inhibidores muy potentes de la síntesis de ADN y el crecimiento celular. Además, la célula reparadora de heridas, el fibroblasto, parece ser excepcionalmente sensible a ciertos tipos de inhibidores del complejo de cobre. Esto dificulta la preparación de complejos de cobre regeneradores de tejidos, ya que incluso algunos tipos de complejos de péptidos de cobre inhiben los fibroblastos al igual que otros complejos pequeños como dietilamina-cobre y trietilamina-cobre.


Análogos de GHK-Cu e hidrazona de la región de unión de cobre de GHK que son inhibidores muy potentes de la replicación celular

Arriba: región de unión de cobre de GHK

Medio: PCPH-Cu (2-Pyridinecarboxaldehyde 2 '' - piridilhidrazona hidrazona cobre (2+))

Abajo: SBH-Cu (salicilaldehído benzoil hidrazona de cobre (2+))

Concentraciones de PCPH-Cu, SBH-Cu, cisplatino y bleomicinsíntesis 50%

Tipos de células en cultivo PCPH-Cu
Nanogramos por ml para una reducción celular del 50% SBH-Cu
Nanogramos por ml para una reducción celular del 50% Cisplatino
Nanogramos por ml para una reducción celular del 50% Bleomicina
Nanogramos por ml para una reducción celular del 50% Fibroblastos humanos normales 0.00003 0.1 No hecho - Riñón humano normal 45 - - Fibrosarcoma de ratón 0.511 2.4 32 Cáncer de vejiga humana 12 34 95 7 Cáncer epitelial de pulmón humano 580 410 870 44 Melanoma humano 0.05 270 6,000 80,000

Referencias sobre química de GHK-Cu

Estudios sobre GHK y estructura y actividad. Se sintetizaron y probaron una variedad de análogos de GHK-Cu para determinar su estimulación de la síntesis de ADN.

Si bien muchos análogos similares a GHK-Cu tenían bioactividad, ninguno igualaba la bioactividad de GHK-Cu

Tripéptido plasmático humano modulador del crecimiento: Relación entre la estructura molecular y la síntesis de ADN en células de hepatoma. Pickart y Thaler FEBS Lett 1979, 104 (1): 119-22 Estudios de cultivo celular de los efectos de GHK complejado con cobre y hierro sobre los patrones de crecimiento celular. Observaciones experimentales de que GHK forma complejos con los iones de metales de transición Cu ++ y Fe ++ in vivo y puede ejercer sus efectos biológicos como un quelato de péptido-metal. A pH fisiológico in vitro, GHK se asocia con cobre iónico, cobalto, hierro, molibdeno, manganeso, níquel y zinc, pero no tiene afinidad por el calcio, manganeso, potasio y sodio. GHK actúa sinérgicamente con cobre, hierro, cobalto y zinc para alterar los patrones de crecimiento celular en cultivos monocapa. Estos metales de transición inducen el aplanamiento celular y la adhesión a las superficies de soporte e inhiben la síntesis de ADN y la producción de ácido láctico cuando el crecimiento está limitado por la reducción de las concentraciones séricas en el medio. Estos efectos inhibidores se neutralizan y la adhesión y el crecimiento intercelulares son estimulados por GHK en medio a concentraciones nanomolares. Cu y Fe son los metales más activos cuando se combinan con GHK. GHK y metales de transición, que parecen formar complejos antes de la interacción con las células. Tripéptido modulador del crecimiento (glicilhistidilisina): asociación con cobre y hierro en plasma, y ​​estimulación de la adhesividad y crecimiento de células de hepatoma en cultivo mediante complejos tripéptido-ión metálico. Pickart y Thaler (Universidad de California, San Francisco, EE. UU.) J Cell Physiol 1980, 102 (2): 129-39 El GHK y el cobre (II) se transportan al interior de las células. La asociación de GHK con cobre y una similitud de homología entre el tripéptido y los sitios de transporte de cobre en albúmina y alfafetoproteína, donde el átomo cúprico está unido a un residuo de histidilo adyacente a un residuo básico, sugirió que GHK puede actuar como un transporte de cobre. Se encontró que GHK forma fácilmente complejos con el cobre (II) y mejora la absorción del metal en las células cultivadas. El tripéptido plasmático modulador del crecimiento puede funcionar facilitando la captación de cobre en las células. Pickart, Freedman, Loker, Peisach, Perkins, Stenkamp y Weinstein Nature 1980, 288, 715-7 Una revisión de la información sobre las acciones biológicas y las relaciones estructura-función como se entendió en 1981. En este momento, las acciones quimioatrayentes de GHK sobre los glóbulos blancos eran desconocidas. Se ha demostrado que la glicilhistidilisina (GHK), un tripéptido del plasma humano, altera la tasa de crecimiento de muchos tipos de células y organismos en los sistemas de cultivo. GHK es óptimamente activo en concentraciones entre 10 y 200 nanogramos / mililitro. La información actual sugiere que GHK funciona como un transportador de metales de transición, en particular cobre, a la superficie celular para su absorción en la célula. El uso de glicilhistidilisina en sistemas de cultivo. Pickart In Vitro 1981,17 (6): 459-66 Determinación de la efectividad de la quelación de GHK para el cobre en condiciones fisiológicas. La interacción entre Cu (II) y el tripéptido GHK modulador del crecimiento en presencia y ausencia de L-histidina se investigó mediante titulación potenciométrica y espectrofotometría de absorción visible a 25 grados C en 0,15 M-NaCl. Los análisis en el rango de pH 3.5-10.6 indicaron la presencia de múltiples especies en solución en el sistema binario y grandes cantidades de complejos ternarios en el sistema ternario. Se evaluó la distribución de especies y las constantes de estabilidad. Los resultados obtenidos de los experimentos de diálisis en equilibrio mostraron que GHK era capaz de competir con la albúmina por Cu (II) a pH 7,5. A concentraciones equimolares de albúmina y péptido, aproximadamente el 42% del Cu (II) se unió al péptido.A las concentraciones fisiológicamente relevantes de Cu (II), albúmina, L-histidina y este péptido, aproximadamente el 6% del Cu (II) se asoció con los componentes de bajo peso molecular. La interacción de cobre (II) y glicil-L-histidil-L-lisina, un tripéptido modulador del crecimiento del plasma. Lau y Sarkar Biochem J 1981199 (3): 649-56 Revisión de las interacciones GHK-metal La evidencia disponible sugiere que GHK actúa como un complejo con metales de transición Complejos de péptidos y proteínas de metales de transición como moduladores del crecimiento celular. Pickart en: Química y bioquímica de aminoácidos, péptidos y proteínas (Marcel Dekker Pub.) 1982, 75-104. La interacción de Cu (II) y Gly-His-Lys se determinó mediante espectroscopía de 13C y 1H-NMR y EPR. La interacción de Cu (II) y GHK, un tripéptido modulador del crecimiento del plasma, se investigó mediante espectroscopía de 13C y 1H-NMR y EPR. El n.m.r. el ensanchamiento de líneas se interpretó en términos de especies mayores y menores formadas en función del pH. El ensanchamiento de la línea de RMN se interpretó en términos de especies mayores y menores formadas en función del pH. Los parámetros de EPR en el rango de pH medio, A paralelo = 19,5 mT yg paralelo = 2,21, encajan bien con la afirmación de que el Cu (II) está ligado a Gly-His-Lys a través de un átomo de oxígeno y tres átomos de nitrógeno en un cuadrado. configuración plana. N.m.r. y e.p.r. investigación de la interacción del cobre (II) y glicil-L-histidil-L-lisina, un tripéptido modulador del crecimiento del plasma. Laussac JP Haran R Sarkar B Biochem J 1983 Feb 1209 (2): 533-9 Estudios de resonancia magnética de GHK y cobre Determinar la estabilidad de GHK-Cu en solución. GHK y GHK-Cu intercambian lentamente cobre (II) en solución. Estudios de PMR de la interacción de Cu (II) y Zn (II) con glicil-l-histidil-1-lisina y péptidos relacionados. Kwa E, Bor-Sheng L, Rose N, Weinstein B, Pickart L.Péptidos 1983, 8, 805-808 Estudios de estructura de GHK-Cu en solución. Para examinar la estructura del complejo Cu (II) de glicil-L-histidil-L-lisina (GHK) en solución, se utilizaron espectroscopias ópticas, de resonancia paramagnética de electrones y de envoltura de eco de espín de electrones. Compuesto de Cu (II) 1: 1 que tiene un espectro EPR similar al de Cu (II) coordinado ecuatorialmente por dos o tres átomos de nitrógeno. Los estudios de eco de espín de electrones demuestran que uno de ellos se encuentra en el anillo de histidil imidazol. Una titulación de pH de Cu (II) -GHK muestra tres transiciones ópticas con pK aparentes de 3,6, 9,2 y 11,4 y molecularidades, con respecto a los protones, de 2, 2 y 1, respectivamente. En el pK más bajo, GHK se une a Cu (II), formando las especies presentes a pH fisiológico. Estos estudios de solución son consistentes con la coordinación de nitrógeno de Cu (II) en Cu (II) -GHK. Estructura del complejo de glicil-L-histidil-L-lisina cobre (II) en solución. Freedman, Pickart, Weinstein, Mims y Peisach (Escuela de Medicina Albert Einstein, Nueva York, EE. UU.) Bioquímica 1982 21 (19): 4540-4

Determinación de la estructura de rayos X de cristales acuosos de GHK-Cu.

La estructura de un complejo de cobre del factor de crecimiento glicil-l-histidil-l-lisina a una resolución de 1,1 angstrom. Perkins CM, Rose NJ, Weinstein B, Stenkamp RE, Jensen, LH, Pickart L. Inorg. Chem Acta 1984, 82, 93-99. Estudios de complejos de cobre inhibidores de células Se sintetizaron y ensayaron una serie de análogos hidrófobos de la estructura de GHL-Cu. Los análogos hidrófobos de la estructura de GHL-Cu inhibieron la síntesis y el crecimiento del ADN celular. Quelantes citotóxicos y quelatos inhibición de la síntesis de ADN en células cultivadas de roedores y humanos por análogos de aroilhidrazona del complejo gly-l-his-l-lys cobre (II). Johnson, Pickart y Rose Inorg Chem Acta 67, págs. 159-165, 1982 Síntesis de análogos inhibidores del crecimiento de GHK-Cu. Una variedad de análogos inhibidores del crecimiento de unión al cobre de GHK-Cu muy sintetizados y probados. Una variedad de análogos de unión al cobre de GHK-Cu tenían una potente actividad en la inhibición de fibroblastos y células de fibrosarcoma a concentraciones de 10exp (-16) M. Inhibición del crecimiento de células cultivadas y un fibrosarcoma implantado por análogos de aroilhidrazona del complejo Gly-His-Lys-Cu (II). Pickart, Goodwin, Burgua, Murphy y Johnson Biochem Pharmacol 1983, 32 (24): 3868-71 Una revisión de la información sobre las acciones biológicas y las relaciones estructura-función como se entendió en 1983. En este momento se desconocían las acciones quimioatrayentes de GHK sobre los glóbulos blancos. Los efectos biológicos y el mecanismo de acción del tripéptido plasmático glicil-l-histidil-l-lisina. Pickart Lymphokines 8, págs.425-446, 1983 Estudios de resonancia de espín electrónico de la acción molecular de análogos de cobre inhibidores del crecimiento de GHK-Cu con células. Se determinó la interacción de dos análogos citotóxicos hidrófobos de GHK-Cu SBH-Cu (salicilaldehídobenzol hidrazona-Cu) y PCPH-Cu (piridina 2-carboxil aldehído 2'-piridil hidrozonato-Cu) con las células. SBH-Cu (II) y PCPH-Cu (II) primero interactúan con los grupos sufhidilo en las células. El Cu (II) se reduce primero a Cu (I), luego se vuelve a oxidar a Cu (II) Formación de aductos entre complejos cúpricos de agentes antitumorales conocidos y células de ascitis de Ehrlich. Antholine, Lyman, Petering y Pickart (Universidad de Wisconsin Milwaukee, EE. UU.) Química biológica e inorgánica del cobre, Adenine Press, págs. 125-137, 1985

GHK forma complejos estables con paladio (II) Se determinó la unión de paladio por GHK.

Conclusión: GHK posiblemente pueda participar en el transporte de Pd (II) en los tejidos y su eliminación a través de los riñones

Estudios de RMN sobre complejos de Pd (II) binarios y ternarios formados por el tripéptido modulador del crecimiento glicilhistidilisina y nucleótidos. Laussac, Pasdeloup y Hadjiliadis J Inorg Biochem 30: 227-38, 1987 Los autores caracterizaron el mecanismo de acumulación de cobre en el cerebro, utilizando cortes de tejido hipotalámico de rata incubados con 67Cu como sistema modelo, distinguiendo dos procesos dependientes de ligandos: un proceso de alta afinidad, baja capacidad y un proceso de baja afinidad y alta capacidad. Los dos procesos fueron similares en que cada uno exhibió: (a) un requerimiento de complejación de cobre para una acumulación óptima de 67Cu y (b) una amplia especificidad de ligando con respecto a los aminoácidos (histidina, cisteína, treonina, glicina) y péptidos (Gly- His-Lys, glutatión) y la ineficacia de la albúmina como ligando facilitador. El tejido cerebral acumula cobre por dos procesos saturables dependientes de ligandos. Un proceso de alta afinidad, baja capacidad y baja afinidad, alta capacidad. Hartter y Barnea (Departamento de Obstetricia y Ginecología, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, Dallas, EE. UU.) J Biol Chem 1988 Jan 15263 (2): 799-805 Estudio de la degradación de GHK en ratas Se desarrolló un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) selectivo y sensible para la determinación de GHK. y su metabolito, L-histidil-L-lisina en plasma de rata. El límite de detección de GHK y HK fue de 50 y 15 ng / ml, respectivamente, y las curvas de calibración fueron lineales en el rango de 0,1-5,0 microg / ml. El método desarrollado se aplicó al estudio farmacocinético de GHK después de que se administrara una dosis única por vía intravenosa a ratas. La GHK se degradó rápidamente a HK, que se eliminó rápidamente. Determinación simultánea de glicil-L-histidil-L-lisina y su metabolito, L-histidil-L-lisina, en plasma de rata mediante cromatografía líquida de alta resolución con derivatización posterior a la columna. Endo, Miyagi y Ujiie (laboratorios farmacológicos, Kissei Pharmaceutical Co., Ltd., Minamiazumi, Nagano, Japón) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997, 692 (1): 37-42

Los experimentos de reversión del envejecimiento y GHK

El descubrimiento de GHK-Cu surgió a partir de estudios sobre el envejecimiento humano y la búsqueda de métodos para revertir ciertos cambios bioquímicos deletéreos que ocurren con el envejecimiento y se intensifican en los sobrevivientes de un ataque cardíaco. El objetivo inicial era encontrar métodos para reducir la concentración de fibrinógeno, la proteína sanguínea. El fibrinógeno sanguíneo elevado reduce el flujo sanguíneo a través de los tejidos y aumenta la tasa de mortalidad.

Los estudios sobre el metabolismo del fibrinógeno concluyeron que había factores en la fracción de albúmina proteica de la sangre que reducían la síntesis de fibrinógeno y estimulaban fuertemente el metabolismo hepático. Algunos de estos efectos se debieron a los ácidos grasos libres unidos a la albúmina, pero el análisis de esta fracción de albúmina encontró un complejo de tripéptido-cobre (GHK-Cu) que mejoró el metabolismo de las células hepáticas y la supervivencia en cultivo. La concentración plasmática de GHK-Cu fue mayor en hombres de 20 años (

200 ng / ml) que en hombres de 70 años (

80 ng / ml). En última instancia, se descubrió que este complejo tripéptido de cobre (GHK-Cu) tiene múltiples acciones que activan la regeneración y remodelación tisular. La mejora de la calidad de la piel y el recambio en personas mayores mediante la aplicación de GHK-Cu podría considerarse un efecto de reversión del envejecimiento.

Observación y pregunta formulada Tipo de estudios Causa supuesta al inicio de los estudios. Resultado / causa real Referencias Los niveles de fibrinógeno en sangre humana aumentan con la edad y la enfermedad: esto aumenta la coagulación de la sangre y se asocia con una tasa de mortalidad considerablemente mayor.

¿Por qué aumentó el fibrinógeno?

Causa esperada: el fibrinógeno no se usaba y se acumulaba en la sangre

Causa real: los estudios de renovación de fibrinógeno humano encontraron que el aumento de sangre se debió a una mayor síntesis hepática de la proteína en personas mayores y sobrevivientes de ataques cardíacos.

Pilgeram LO, Pickart, L Bandi, Z, Control de ácidos grasos del recambio de fibrinógeno en el envejecimiento y la aterosclerosis. VII Congreso Internacional de Gerontología, junio de 1964, págs. 451-460. Pickart L, Pilgeram LO. El papel de la trombina en la biosíntesis de fibrinógeno. Thromb Diath Hemorrh. 1967 Mayo 3117 (3-4): 358-64. Pilgeram LO, Pickart L. Control de la biosíntesis de fibrinógeno: el papel de los ácidos grasos libres. J Atheroscler Res. 1968, 8: 155-66. El fibrinógeno se sintetiza en el hígado.

¿Se observó el aumento de la síntesis de fibrinógeno en personas mayores y pacientes cardíacos debido a cambios en el hígado o se debió a factores en la sangre que perfundieron el hígado?

Medir la síntesis de fibrinógeno en tejido hepático humano aislado de personas de 20 a 30 años y en personas de 60 a 80 años. Se incubó el tejido hepático joven (20-30) con sangre del grupo joven (20-30) o del grupo viejo (60 -80). p (60-80)

Asumir causa: el aumento de la síntesis de fibrinógeno con la edad se debe a cambios en el tejido hepático.

Causa real: el aumento en la síntesis de fibrinógeno en las personas mayores no se debió a cambios en el tejido hepático, sino casi en su totalidad a factores en la sangre más vieja.

Pickart L, Thaler MM. Supresión de la hiperfibrinogenemia asociada a tumores y acidemia grasa libre con p-fenoxibenzalbutirato (clofibrato). Cancer Res. 1979 Oct39 (10): 3845-8. Pickart, L. Metabolismo de las grasas, el sistema fibrinógeno / fibrinolítico y el flujo sanguíneo: nuevos potenciales para el tratamiento farmacológico de la enfermedad coronaria. Farmacología 198123 (5): 271-80 Pickart L Supresión de la síntesis de fibrinógeno en fase aguda por un fármaco hipolipidémico (clofibrato). Int J Tissue React. 1981 3 (2): 65-72.

¿Cuáles son los factores en la sangre que estimularon o inhibieron la síntesis de fibrinógeno? Estudió el efecto de varias fracciones de proteínas plasmáticas que afectan la síntesis de fibrinógeno en ratones. No. La fracción de albúmina del plasma tuvo una acción supresora sobre la síntesis de fibrinógeno que devolvió los patrones sintéticos a los de una persona más joven. Algunos efectos parecían deberse a los ácidos grasos libres, pero esta fracción de albúmina en sí también estimulaba el metabolismo de las células hepáticas. Pickart L, Thaler MM. Ácidos grasos, fibrinógeno y flujo sanguíneo: un mecanismo general de hiperfibrinogenemia y sus consecuencias patológicas. Hipótesis med. 6 de mayo de 1980 (5): 545-57. Pickart L, Thaler MM. Ácidos grasos libres y albúmina como mediadores de la síntesis de fibrinógeno estimulada por trombina. Am J Physiol. Abril de 1976 230 (4): 996-1002. ¿Cuál fue el factor en la fracción de albúmina que estimuló el metabolismo del hígado? Estudia la proteína albúmina y varias moléculas pequeñas asociadas con la proteína.

Causa esperada: los efectos se debieron a la molécula de albúmina.

Causa real: los efectos no se debieron a la albúmina, sino a un pequeño complejo péptido-metal asociado con la proteína.

Tripéptido en el plasma humano que aumenta la supervivencia de los hepatocitos y el crecimiento de las células del hepatoma. Pickart Ph.D. Tesis en Bioquímica, Universidad de California, San Francisco, 1973 Thaler MM, Pickart L Propiedades metabólicas y promotoras del crecimiento del tripéptido sérico y su análogo sintético. En: Expresión génica y carcinogénesis en hígado cultivado. (Academic Press, 1975) págs. 292-310. ¿Cuál era la estructura del complejo péptido-metal? Aislamiento y análisis químico. El complejo estaba compuesto por un tripéptido, glicil-l-histidil-l-lisina más cobre 2+ aproximadamente equimolar o GHK-Cu Schlesinger DH, Pickart L, Thaler MM. Artículos relacionados, Proteína El tripéptido sérico modulador del crecimiento es glicil-histidil-lisina. Experientia. 1977, marzo de 1533 (3): 324-5. ¿Cuál fue la función de GHK-Cu? Variantes sintetizadas de GHK-Cu que inhiben el crecimiento celular en cultivo celular, reparación de heridas y algunos tumores en animales. Durante los estudios de los análogos de cobre inhibidores del crecimiento de GHK-Cu en la reparación de heridas, se observó que GHK-Cu, que se usó como sustancia de control, estaba curando las heridas mientras que los inhibidores detuvieron la curación de las heridas. Se concluyó que GHK-Cu tiene una acción estimulante sobre la cicatrización de heridas. Pickart L, Lovejoy S. Actividad biológica del factor de crecimiento de unión al cobre del plasma humano glicil-L-histidil-L-lisina. Métodos Enzymol. 1987147: 314-28.

GHK-Cu sigue siendo la mejor molécula para tratamientos médicos internos. La función fisiológica de GHK-Cu en el cuerpo humano parece ser una señal protectora y reparadora de los tejidos dañados. Es posible que GHK-Cu pueda usarse clínicamente para proteger y acelerar la reparación de órganos dañados. H. Paul Ehrlich descubrió que la inyección intramuscular de GHK-Cu en el músculo del muslo de los conejos elevaba los macrófagos circulantes de la herida en la sangre y aceleraba la curación de heridas distantes en la oreja del conejo. Los pacientes pueden ser tratados previamente con GHK-Cu antes de la cirugía para mejorar la reparación posquirúrgica. Basado en modelos de conejo, debería ser suficiente una dosis de 30 miligramos de GHK-Cu. La molécula también es muy beneficiosa en el cultivo de órganos renales. Por lo tanto, GHK-Cu podría infundirse en pacientes con insuficiencia renal para ejercer sus acciones protectoras y reparadoras de tejidos. Los posibles objetivos clínicos serían lesiones o fallos del sistema de tejidos como la piel, los huesos, los riñones y el tracto intestinal gastrointestinal. GHK-Cu podría administrarse después de una lesión tisular traumática, como accidentes automovilísticos. Los péptidos de cobre altamente adhesivos y resistentes a la rotura más nuevos que se están desarrollando deberían resultar mejores para usos cosméticos y superficiales, como la curación dermatológica posterior a la intervención y el desarrollo de procedimientos quirúrgicos sin cicatrices. Los péptidos de cobre parecen ser muy útiles para la recuperación posterior al procedimiento después de peelings, dermoabrasión y rejuvenecimiento con láser. La combinación de hidroxiácidos y estos péptidos lentamente, durante un período de varios meses, reduce las cicatrices antiguas y las lesiones cutáneas. Este método es económico y evita las complicaciones que suelen ocurrir después de los peelings químicos o los tratamientos con láser. En estudios experimentales, el uso de este tipo de péptidos de cobre después de procedimientos quirúrgicos a menudo da como resultado una curación sin cicatrices o casi sin cicatrices.

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Discusión

La proteína de la cápside de norovirus VP1 contiene determinantes de la encapsulación del genoma y el ensamblaje de partículas, así como la penetración y entrada de la membrana, lo que representa una parte de la maquinaria molecular necesaria para la infección. Aquí hemos definido estructuralmente la interacción entre el dominio MNoV P y el receptor de entrada CD300lf recién descubierto, una interacción que parece requerir la coordinación interfacial de iones metálicos. Además, en el presente documento identificamos los ácidos biliares como cofactores para la infección por MNoV y establecemos los determinantes estructurales del dominio P utilizados en la participación de los ácidos biliares GCDCA y LCA. Estos resultados están respaldados por una serie de ensayos biofísicos que han incorporado análisis de mutaciones basadas en estructuras. Estos estudios estructurales y funcionales tienen implicaciones importantes para nuestra comprensión de la biología de los norovirus.

Interacciones entre el dominio P y su receptor celular CD300lf.

Debido a su posición en la cara externa de la cápside viral y su orientación por anticuerpos neutralizantes (18 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –23, 29, 34, 35), el subdominio P2 fue un candidato principal para la participación del receptor CD300lf. De acuerdo con esto, mostramos que CD300lf contacta con una hendidura en P2 formada por los bucles AB y DE, con dos receptores separados de la interfaz del dímero del dominio P (Fig. 1). El calicivirus felino (FCV) y el calicivirus Hom-1 emplean la molécula de adhesión A (JAM-A) y proteínas relacionadas como receptores (36, 37). La estructura crio-EM de la cápside de FCV en complejo con los dos dominios extracelulares similares a Ig de fJAM-A indica que este receptor también se une al subdominio P2, aunque los receptores parecen participar en la parte superior del dominio P cerca de la interfaz del dímero ( 38). Algunos norovirus humanos utilizan esta misma región proximal de interfase de dímeros de P2 para unirse a glucanos HBGA (25, 28, 39, 40). Nuestros datos estructurales están sólidamente respaldados por análisis de unión cuantitativos (SPR, BLI e ITC), donde la mutación de determinantes críticos en los bucles CD300lf CRD3 y CC ′ junto con mutaciones en el dominio P bucle AB, bucle DE y hebra E resultan en la interrupción de las interacciones.

La unión de CD300lf al dominio P de MNoV se bloqueó de forma potente usando el anticuerpo neutralizante A6.2.1. Los modelos Cryo-EM sugieren que el sitio de unión de A6.2.1 abarca los bucles AB y EF de P2, una conclusión respaldada tanto por mutantes de escape como por estudios de mutagénesis dirigida al sitio (21, 26, 34, 41). Esto predice que el sitio de contacto A6.2.1 se superpone con el sitio de contacto CD300lf en el dominio P visto en nuestra estructura cocompleja (Apéndice SI, Fig. S6), apoyando firmemente el concepto de que A6.2.1 inhibe la infección por MNoV bloqueando la unión celular. El anticuerpo monoclonal 2D3.7 neutraliza ampliamente las cepas de MNoV y mediante crio-EM se une muy cerca del sitio A6.2.1 aunque en un ángulo que le permite hacer más contacto con los bucles AB y EF (21). Según nuestros estudios estructurales, parece probable que 2D3.7 también neutralice MNoV bloqueando el sitio de unión de CD300lf.

El papel de la multivalencia en el apego celular.

El dominio MNoV P entierra ∼630 Å 2 de superficie accesible al solvente en la interfaz de contacto CD300lf, un área notablemente más pequeña que la enterrada en muchas otras interfaces receptor-virus. Por ejemplo, el área de contacto enterrada por la gp120 del VIH y su receptor CD4 es ∼742 Å 2 (42), entre el rinovirus HRV14 y su receptor ICAM ‐ 1 es ∼990 Å 2 (43), entre el coxsackievirus A21 y su receptor ICAM-1 es ∼970 Å 2 (44), y entre el poliovirus y el receptor de poliovirus CD155 es ∼1,300 Å 2 (45).De acuerdo con esta pequeña área de contacto, la afinidad entre el dominio P y CD300lf es relativamente débil con una KD de ∼25 μM para la unión monotípica medida en solución por ITC. La unión de baja afinidad observada entre el dominio P y CD300lf sugiere que la unión celular podría estar impulsada por la avidez, lo que requiere que los dominios P ​​en un virión se comprometan simultáneamente con múltiples proteínas CD300lf en la superficie celular. Por lo tanto, acoplamos la estructura de rayos X del complejo en un modelo derivado de crio-EM de la partícula MNoV. Encontramos que los dominios CD300lf se agrupan de tres en tres en la superficie del virión (Fig.7A). La distribución de los contactos CD300lf se puede ver eliminando las moléculas CD300lf del modelo (Fig.7B). Esta distribución deja en claro que cada grupo de CD300lf está compuesto por receptores de tres dímeros de dominio P diferentes (Fig.7C). Este modelo de acoplamiento da como resultado una pequeña superposición de dominios CD300 (Fig.7C), que puede resolverse mediante la movilidad de los dominios P, que están conectados de manera flexible al dominio de capa de VP1. Estos resultados respaldan un modelo en el que cada virión puede realizar múltiples compromisos de CD300lf para impulsar la unión y la entrada de MNoV. Realizamos varios estudios de unión utilizando una proteína de fusión Fc-CD300lf, revelando que el reactivo bivalente puede unirse al dominio P recombinante y MNoV de lisados ​​de células infectadas con una avidez al menos 50 veces mayor que las afinidades de unión monotípicas que observamos. Debido a que nuestros datos son más consistentes con la necesidad de interacciones multivalentes entre el dominio P y varios receptores CD300lf de la superficie celular, la fuerza de estas interacciones bivalentes puede ser fisiológicamente relevante.

Acoplamiento del complejo de dominio CD300lf-P en un modelo derivado de crio-EM del virión MNoV. (A) Las superficies accesibles al disolvente de CD300lf se muestran en amarillo, con las subunidades del dominio P en azul y verde. Los dominios CD300lf se agrupan de tres en tres a lo largo de la superficie del virión. Cada trímero de CD300lf está formado por receptores de tres dímeros de dominio P diferentes. (B) Los contactos del CD300lf están mapeados en amarillo en la superficie del modelo después de quitar el CD300lf. La simetría quíntuple, triple y doble está marcada con un pentagrama, triángulo o elipse blanco, respectivamente. (C) (Derecha) Una vista de arriba hacia abajo (la misma orientación que en A) para tres dímeros P en un grupo de trímeros con la región de la cáscara debajo en azul. (Izquierda) Una vista lateral de los tres dímeros P. Observe cómo los terminales CD300lf C (marcados con cilindros rojos) se agrupan en el centro de cada regulador y se superponen ligeramente. Los óvalos magenta con una letra B blanca marcan bolsas visibles de unión de ácidos biliares.

Mimetismo molecular por MNoV en el compromiso del receptor.

Nuestra estructura de CD300lf en complejo con fosfocolina ha definido el sitio de unión del ligando del huésped utilizado por el receptor. El grupo de la cabeza del ligando está orientado de modo que la cola del ácido graso se extienda fuera del bolsillo lejos de la superficie de la célula portadora de CD300lf, de acuerdo con la función de CD300lf como receptor de lípidos. La orientación del ligando y la coordinación del metal son muy similares a las utilizadas por TIM-4, una molécula reguladora inmunitaria relacionada, para unirse a la fosfatidilserina (Apéndice SI, Figura S8) (46). Al comparar las estructuras CD300lf unidas a la fosfocolina o al dominio P de MNoV, hemos revelado con detalles atómicos precisos cómo la cápside viral imita la unión de un ligando CD300lf y el papel de los cationes divalentes en ambos procesos. Esta forma de mimetismo molecular predice que la interacción entre el dominio P y CD300lf durante la infección sería incompatible con la unión simultánea de ligandos al bolsillo de unión a lípidos de CD300lf, lo que sugiere que la infección podría estar regulada por ligandos del receptor de alta afinidad. Los ligandos bacterianos también pueden unirse a miembros de la familia CD300 (10), lo que aumenta la posibilidad de que las interacciones entre las bacterias y el virus puedan implicar la unión de ligandos a CD300lf que, a su vez, compiten por las interacciones con el dominio P.

El papel de la bilis en la infección por MNoV.

Anteriormente mostramos que la unión eficiente de MNoV a las células y la infección requiere un cofactor de suero estable al calor de pequeño peso molecular (5). Aquí mostramos que el ácido biliar GCDCA puede servir como cofactor aumentando la unión celular y la infección. No sabemos si GCDCA es responsable de la actividad originalmente observada en suero. Es probable que la función de este ácido biliar implique la unión directa a la proteína de la cápside viral porque nuestras estructuras cristalinas del complejo del dominio CD300lf-P unido con GCDCA y LCA revelaron dos bolsas de unión por dímero del dominio P que pueden acomodar estos ácidos biliares. La ubicación de la bolsa de ácidos biliares fue sorprendente por varias razones. Primero, la bolsa de ácidos biliares está alejada de la interfaz del dominio CD300lf-P, lo que sugiere que si los ácidos biliares funcionan alterando la interacción del dominio CD300lf-P, esto debe ser a través de un efecto alostérico de larga distancia. En segundo lugar, la bolsa de ácidos biliares es distinta de los sitios de unión de glucanos observados en los dominios P ​​del norovirus humano y murino (25, 40), lo que sugiere que los dominios P ​​del norovirus son promiscuos en su capacidad para unirse a diversas moléculas biológicas pequeñas y argumentan además que la interacción entre los norovirus y las células diana se regula en múltiples niveles. Parece probable que la eficacia de la infección por norovirus de las células en cultivo requiera que cada uno de estos diferentes niveles de control se corresponda perfectamente para evitar una infección abortiva. En tercer lugar, la unión de GCDCA y LCA al dominio P de MNoV no indujo reordenamientos estructurales significativos en el dominio P o en la interfaz CD300lf. Encontramos que la adición de GCDCA tenía un efecto pequeño (aproximadamente el doble) pero reproducible sobre la unión de CD300lf soluble al dominio P en presencia de cationes divalentes. Es posible que este pequeño efecto, sumado a las muchas copias del dominio P en el virión, tenga importancia biológica. Sin embargo, esto es especulativo y el mecanismo molecular de la función del cofactor sigue siendo una pregunta abierta. Es intrigante considerar que los ácidos biliares, en lugar de modular directamente las interacciones del receptor: dominio P, alteran las conversiones estructurales que ocurren cuando el virus ingresa a la célula para liberar su ARN en el citoplasma o la conformación del virión en sí de formas no detectadas. licitando estudios del dominio P y CD300lf en solución.

También encontramos que la adición de calcio y magnesio también aumenta la infección. Nuestros datos estructurales indican que hay al menos tres sitios de unión de cationes divalentes asociados con la unión de CD300lf a cada monómero del dominio P. Dos de estos están en la interfaz de unión entre el dominio P y CD300lf y probablemente faciliten la interacción. Un tercer ión metálico se encuentra a medio camino entre el receptor y los sitios de unión de los ácidos biliares del dominio P, y no participa directamente en ninguna interacción. Las estructuras cristalinas y la unión de ITC del dominio MNoV P con CD300lf mostraron que el magnesio o el calcio pueden soportar la formación de complejos. De particular interés, el Ca 2+ está presente en altas concentraciones en la bilis (47), por lo que es razonable proponer que el calcio podría estar presente en los sitios de infección por MNoV (48). Es intrigante especular que la disponibilidad de cationes divalentes en el cuerpo, que pueden no estar disponibles en el medio ambiente, podría fomentar la infectividad del virus una vez que alcanza su objetivo.

Implicaciones de estos estudios.

Estos estudios respaldan el concepto de que los norovirus han evolucionado para depender de moléculas pequeñas, ya sea por mimetismo molecular de los lípidos del huésped o por depender de cofactores como los ácidos biliares y los cationes divalentes para los pasos críticos de la infección. Fisiológicamente, es atractivo considerar que la presencia de ácidos biliares y Ca 2+ en el intestino aguas abajo del colédoco, en combinación con el tropismo del virus por las células del penacho como única célula epitelial que expresa CD300lf (7), explica la tropismo del virus. Esto se suma al hallazgo anterior de que el tropismo de células de penacho es conferido por los efectos combinatorios de la citocina del huésped IFNλ y la proteína no estructural NS1 de MNoV (49). Además, aunque no pudimos observar de forma reproducible un efecto de la adición de LCA sobre la unión o la infectividad debido a problemas de solubilidad, este ácido biliar secundario también puede unirse al dominio MNoV P en el bolsillo utilizado por GCDCA. Esto indica que los ácidos biliares secundarios podrían desempeñar un papel fisiológicamente importante in vivo. Sin embargo, el realce parece ser bastante específico porque muchos otros ácidos biliares no aumentaron la infección. Debido a que no hemos muestreado exhaustivamente los ácidos biliares primarios y secundarios en el intestino, es muy posible que en el futuro se descubran cofactores adicionales o incluso inhibidores de la infección por norovirus.

Además de identificar que el dominio P del norovirus interactúa con un cofactor soluble, los estudios estructurales presentados aquí plantean la posibilidad de diseñar análogos de ácidos biliares biodisponibles por vía oral efectivos para el tratamiento de la infección por norovirus humano, que también se ha demostrado que mejora con la bilis ( 30). Además, demostramos previamente que las bacterias intestinales juegan un papel crítico en el establecimiento de una infección entérica persistente por MNoV (50). Debido a que las bacterias intestinales están involucradas en la metabolización de los ácidos biliares primarios en ácidos biliares secundarios, esto plantea la posibilidad de que las interacciones transrenales entre el norovirus y las bacterias entéricas se produzcan a través de alteraciones en los ácidos biliares en el intestino. De hecho, los antibióticos de amplio espectro podrían alterar la infección por norovirus a través de alteraciones en el metabolismo de los ácidos biliares (50, 51).


Métodos

Declaración de Ética

Todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. Este protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, el Comité de Ética e Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Makerere (SOMREC) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Uganda (UNCST).

Cohorte de estudio y recogida de muestras

Se obtuvieron muestras de los participantes inscritos en el estudio "HIPPOS", un estudio de cohorte prospectivo en curso, iniciado en 2012, de pacientes con SK que iniciaron el tratamiento en el Uganda Cancer Institute (UCI) en Kampala, Uganda. Los participantes eran elegibles para el estudio HIPPOS si tenían> 18 años de edad con SK comprobado por biopsia y no habían recibido terapia antirretroviral (ART) y quimioterapia en el momento de la inscripción. Los participantes asistieron a 12 visitas del estudio durante un período de un año y recibieron tratamiento para el SK que consistía en TAR y quimioterapia (una combinación de bleomicina y vincristina o paclitaxel) según los protocolos estándar de los médicos de la UCI. En cada visita, los participantes recibieron un examen físico detallado para evaluar la respuesta clínica utilizando los criterios de respuesta ACTG KS [57].

Los participantes proporcionaron muestras de plasma en cada visita para las pruebas de carga viral de KSHV, CD4 y VIH y, además, proporcionaron hasta 12 biopsias de lesiones de SK antes, durante y después del tratamiento. Las biopsias de tumores KS se obtuvieron usando herramientas de biopsia con punzón de 4 mm después de limpiar la piel con alcohol, y se congelaron rápidamente en el sitio de la clínica y se almacenaron en nitrógeno líquido (LN2) o se colocaron en RNA posterior (Sigma-Aldrich, Cat. # R0901) y se almacenaron a -80 ° C. Los médicos del estudio recolectaron hisopos de la mucosa oral en cada visita del estudio y los participantes recolectaron ellos mismos hisopos orales en casa durante 1 semana después de la visita después de la educación sobre la técnica de recolección de muestras, como previamente validado por nuestro grupo en Uganda [58]. Brevemente, se inserta un hisopo de Dacron en la boca y se frota vigorosamente a lo largo de la mucosa bucal, las encías y el paladar duro. A continuación, el hisopo se coloca en 1 ml de tampón de digestión esterilizado por filtración [59] y se almacena a temperatura ambiente [60] antes de colocarlo a -20 ° C para su almacenamiento.

Preparación de ADN

El ADN se extrajo de 300 μl de lisados ​​tumorales homogeneizados usando el Mini Kit AllPrep DNA / RNA (QIAGEN, Cat. # 80204) y se eluyó en 100 μl de tampón EB. Para las muestras de hisopos orales, se extrajo el ADN del eluido de la punta del hisopo utilizando el mini kit QIAamp (Qiagen, Cat. # 51304) siguiendo el protocolo del fabricante. La purificación del ADN de la saliva estabilizada en RNAprotect Saliva Reagent (Qiagen) se realizó siguiendo el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones: No hubo sedimentación inicial ni lavado con PBS, se usaron 20 μL de proteinasa K por 200 μL de muestra y el ADN se eluyó en 50 μL de agua. El ADN se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoScientific).

Todas las preparaciones de PCR se realizaron en una sala limpia de PCR, excepto por la adición de plantillas de control. La PCR se realizó usando el kit PrimeSTAR GXL (Takara, Cat. # R050B) con ThermaStop (Thermagenix) agregado. Las condiciones del ciclo fueron: 98 ° C durante 2 minutos 35 ciclos de 98 ° C durante 10 segundos, 60-65 ° C (según el cebador) durante 15 segundos, 68 ° C durante 1 min / kb 68 ° C durante 3 minutos y luego mantener a 4 ° C. Las secuencias de cebadores se enumeran en Tabla S1.

Cuantificación del número de copias

Los números de copias del genoma de KSHV se cuantificaron mediante PCR digital de gotitas (ddPCR) utilizando el generador y lector de gotitas QX200 (Bio-Rad), con ddPCR SuperMix para sondas (sin dUTP) (Bio-Rad, nº de cat. 186-3024). Cebadores y sondas (Tabla S1) fueron diseñados para detectar 4 genes únicos de KSHV K2 / vIL-6, ORF16 / vBCL-2, ORF50 / RTA y ORF73 / LANA (Figura 1A), con el número de copias del genoma de KSHV informado como el promedio de las 4 medidas. 420 ng de ADN de la línea celular BCBL-1 diluido 1: 10,000 (

475 copias del genoma) como control positivo, 1 ng de ADN genómico humano (Bioline, nº de cat. BIO-35025) como control negativo y agua como control sin molde. Las condiciones del ciclo fueron: 95 ° C durante 10 minutos 40 ciclos de: 94 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 1 minuto un ciclo a 98 ° C 10 durante minutos y luego mantener a 12 ° C. El porcentaje de KSHV en el objetivo se calculó usando la cuantificación del número de copias por ddPCR normalizado a la concentración total de ácido nucleico.

(A) Representación esquemática de un genoma de KSHV lineal, con genes coloreados en verde y las principales regiones de repetición en naranja. Las ubicaciones de los genes K1, vIL-6, vBCL-2, RTA, LANA y K15 utilizados para la cuantificación del genoma se indican en verde. (B) Cobertura de lectura sin procesar (azul claro), sUMI-consenso (azul) y dUMI-consenso (azul oscuro) a lo largo del de novo ensamblado, genoma BCBL-1 KSHV. (C) Gráfico de burbujas de variantes de secuencia menores. Cada burbuja representa una posición dentro del genoma en la que se detectó una base variante o indel, coloreada según se predijo que serían mutaciones silenciosas o que alteran las proteínas. Las mutaciones que probablemente serían silenciosas incluyeron mutaciones puntuales sinónimas e intergénicas, mientras que las mutaciones que alteraron las proteínas incluyeron mutaciones no sinónimas, sin sentido y con desplazamiento del marco de lectura. La altura de la burbuja representa la frecuencia base variante entre las lecturas de consenso de dUMI en esa posición. Las columnas grises verticales representan regiones de repetición enmascaradas en las que no fueron posibles alineaciones fiables.

Adición de UMI y preparación de la biblioteca (Fig 2)

Se cortaron fragmentos de ADN de 500 pb, 10-20 ng / μl de extracto de ADN en 100 μl de tampón TLE refrigerado (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) utilizando un Bioruptor (Diagenode) a alta potencia durante hasta 15 min. Los tamaños de los fragmentos se evaluaron en geles de agarosa al 1,5%. El ADN cizallado se purificó mediante perlas usando un volumen de 1,2X de Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter Cat. # A63880) y se eluyó en 50 μL de agua. La preparación de la biblioteca (reparación de extremos, colas A y ligadura con adaptador) se realizó usando el kit de preparación de bibliotecas KAPA HyperPrep (n.º de cat. KR0961 / KK8503). Los adaptadores de ADN de doble hebra contenían una secuencia dUMI aleatoria de 12 pb y una secuencia espaciadora definida de 5 pb añadida a las secuencias del adaptador TruSeq de Illumina [61] (S1 Higo). Posteriormente, el ADN se purificó en perlas con un volumen de perlas 1X y se eluyó en 50 μl de agua.

Cada participante del estudio contribuyó con múltiples tumores KS e hisopos orales, pero aquí solo se informaron las muestras con las cargas virales más altas. Se prepararon bibliotecas de secuenciación a partir de extractos de ADN de cada muestra con adaptadores que contenían identificadores moleculares únicos dúplex (dUMI, ver S1 Higo). Las bibliotecas de ADN marcadas con adaptador se enriquecieron utilizando cebos de ARN biotinilados homólogos a las secuencias de KSHV. El ADN capturado se amplificó mediante PCR a niveles suficientes para la secuenciación de Illumina HiSeq. Para la mayoría de las muestras, las bibliotecas se sometieron a una segunda ronda de enriquecimiento y amplificación por PCR. Tras la secuenciación, primero se ensamblaron los genomas completos de KSHV de novo de cada muestra sin el uso de dUMI. Los genomas específicos de la muestra generados (consenso de la muestra) se utilizaron luego como referencia para mapear el consenso de lecturas con etiquetas dUMI idénticas (es decir, lecturas de consenso dUMI).

Las bibliotecas de ADN se sometieron a amplificación previa al enriquecimiento con los cebadores mws13 y amp mws20 (Tabla S1 y S1 Higo). Las condiciones de PCR fueron: 95 ° C 4 minutos 5-8 ciclos de 98 ° C 20 segundos, 60 ° C 45 segundos, 72 ° C 45 segundos 72 ° C 3 minutos, 4 ° C mantener. Si la elución purificada con perlas de la reparación del extremo y el paso del adaptador tenía más de 240 ng en total, se dividió en 50 μL de reacciones de PCR de ≤240 ng y se agruparon después de la amplificación. A continuación, los productos de PCR se purificaron por microesferas como anteriormente con microesferas de volumen 1,2X y elución en 100 μl de agua, se cuantificaron con Nanodrop y se evaluaron sus tamaños con un bioanalizador (Agilent DNA 7500) o Qiaxcel (QIAGEN AM420).

Enriquecimiento de bibliotecas y secuenciación de amplificadores

Los cebos de ARN biotinilado para enriquecer las secuencias de KSHV en la biblioteca fueron los diseñados en [62] y se obtuvieron de Agilent, Inc. (Santa Clara, CA). El diseño fue un mosaico 12X de 120 pb del genoma del aislado GK18 de KSHV (Genbank ID: AF148805.2). La diversidad de la biblioteca de cebos se incrementó aún más al incluir secuencias K1, ORF75, K15, ORF26 y TR de las cepas JSC-1 (Genbank ID: GQ994935.1), DG1 (Genbank ID: JQ619843.1), BC-1 (Genbank ID: U75698.1), BCBL-1 (Genbank ID: HQ404500.1), Sau3A (Genbank ID: U93872.2) y de todos los aislados occidentales y africanos en [29,33] (Genbank ID: AF130259, AF130266, AF130267, AF130281, AF130305, AF133039, AF133040, AF133043, AF133044, AF151687, AF171057, AF178780, AF178810, AF220292, AF220293, AY329032, KT271453-KT271468).

El enriquecimiento de la diana se realizó utilizando SureSelect Target Enrichment Kit v1.7 (Agilent) con todos los volúmenes sugeridos reducidos a la mitad. El ADN hibridado con cebos de ARN biotinilado se capturó con perlas de estreptavidina (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Invitrogen) y se resuspendió en 20 μl de agua. La mezcla de perlas de ADN-estreptavidina se utilizó directamente en la amplificación por PCR posterior al enriquecimiento con los cebadores mws13 y mws21, el último de los cuales incluye una secuencia de índice de muestra (Tabla S1 y S1 Higo). El número de ciclos de PCR varió de 10 a 16, con productos monitoreados cada 2 a 3 ciclos en una TapeStation (Agilent) para garantizar los tamaños de fragmentos correctos (

500 pb). Cuando la sobreamplificación dio como resultado tamaños de fragmentos de biblioteca mucho mayores de lo esperado, se realizó un único ciclo de PCR de "reacondicionamiento" con reactivos frescos [63]. Los productos de PCR se limpiaron usando perlas AMPure XP de volumen 1,2X y la biblioteca de ADN eluida se secuenció usando Illumina HiSeq 2500 con lecturas finales emparejadas de 100 pb.Para algunas muestras de tumores con un número bajo de copias de KSHV y todas las muestras de hisopos orales, se realizó un segundo enriquecimiento de la biblioteca.

De novo ensamblaje de genomas de consenso de muestra

Inicialmente, un genoma de KSHV de consenso de muestra (Figura 2) fue generado de novo de lecturas paired-end de cada muestra usando scripts personalizados (S2 Higo, https://github.com/MullinsLab/HHV8-assembly-SPAdes). En esta etapa, los primeros 17 pb de los extremos de lectura se recortaron para eliminar las secuencias dUMI. A continuación, las lecturas se sometieron a un filtrado de calidad en ventana utilizando hoz pe [64] con un umbral de calidad de 30 y un tamaño de ventana del 10% de la longitud de lectura. Las lecturas filtradas se alinearon con un genoma humano (GRCh38 p12, GenBank GCA_000001405.27) usando bwa mem [sesenta y cinco]. Las lecturas no asignadas se utilizaron como entrada en el ensamblador de novo SPAdes v3.11.1 [66], con la configuración -k 21,35,55,71,81. Esto a menudo produjo de 3 a 4 andamios que juntos abarcaron todas las regiones de secuencia única de 131 kb de KSHV, delimitadas por las principales regiones de repetición: Internal Repeat 1 (IR1), Internal Repeat 2 (IR2), LANA central repeat y Terminal Repeat (TR ) (Figura 1A). A continuación, todos los andamios de más de 500 pb se alinearon utilizando bwa mem al genoma de referencia KSHV aislado GK18. A partir de los andamios alineados se generó un borrador del genoma en Geneious (Biomatters, Ltd) con corrección manual según fuera necesario. Para finalizar el montaje, se utilizó GapFiller v1.1 [67], configurando bwa como el alineador y el extremo emparejado filtrado se lee como la biblioteca de entrada. Los genomas se anotaron en Geneious basándose en la referencia GK18, añadiendo también la anotación para ARN no codificante largo T1.4 basada en [68]. Las principales regiones de repetición se enmascararon con N, ya que se resolvieron deficientemente mediante el ensamblaje de lecturas cortas que se pueden asignar a múltiples ubicaciones dentro de las regiones de repetición.

Identificación de variantes a partir de lecturas de consenso de dUMI

Las lecturas paired-end, incluidas sus etiquetas de secuencia dUMI, fueron mapeadas por bwa a genomas de consenso de muestra (Figura 2) utilizando un Makefile adaptado de [61] (https://github.com/MullinsLab/Duplex-Sequencing). Brevemente, todas las lecturas que se mapean en la misma posición genómica fueron colapsadas por UMI de una sola hebra (sUMI) para hacer lecturas de consenso de sUMI (S2 Higo). Se emparejaron etiquetas UMI complementarias de hebras opuestas para crear lecturas de consenso dUMI, eliminando así casi todas las incorporaciones erróneas de la polimerasa de PCR y los artefactos de quimera. A continuación, se recortaron nueve bases de ambos extremos de lectura para minimizar los artefactos en los extremos de lectura. Las discrepancias entre las lecturas de consenso de dUMI mapeadas y los genomas de consenso de la muestra se inspeccionaron manualmente en Geneious y se corrigieron las desalineaciones alrededor de las ejecuciones de homopolímeros. Solo las discrepancias restantes se consideraron variantes de secuencia que existían antes de la amplificación por PCR.

Todos los alineamientos de secuencias del genoma y subgenoma se generaron utilizando MAFFT [69] [algoritmo FFT-NS-i x1000, matriz de puntuación 1PAM / k = 2], y todos los árboles filogenéticos se infirieron utilizando RAxML [70] (-fd, GTR gamma, N = 100 árboles iniciales), utilizando un genoma de KSHV representativo de cada individuo. La red filogenética NeighbourNet se generó utilizando SplitsTree5, excluyendo los sitios gap [71]. Las secuencias del genoma de consenso se depositaron en GenBank (números de acceso MT510648 — MT510670, MT936340, ver tabla 1) anotado con los reordenamientos genómicos, cuando están presentes.

Análisis de integración

Las búsquedas sistemáticas para la integración de KSHV en el genoma humano se realizaron de dos formas. Primero, se buscó en cada biblioteca usando BLASTN local contra secuencias humanas y KSHV y luego usando el script Perl SummonChimera [72] para extraer coordenadas de sitios de integración potenciales. En segundo lugar, se añadió un genoma de KSHV de consenso de muestra como un cromosoma extra a la referencia del genoma humano GRCh38 p12. La referencia del genoma humano adjunta se utilizó para mapear las lecturas de consenso de sUMI a través de Speedseq [73] para generar archivos de alineación con solo lecturas discordantes o divididas. Estos se introdujeron en LUMPY para el análisis de variantes estructurales [74]. Las secuencias de cromosomas humanos unidas a secuencias de KSHV se consideraron sitios de integración putativos.


Estructura del ADN

En la década de 1950, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins, Francis Crick y James Watson estaban investigando activamente la estructura molecular del ADN. Franklin estaba usando cristalografía de rayos X en el laboratorio de Wilkins para observar los patrones formados por rayos X disparados a través de fibras de ADN cristalizado. Watson y Crick pudieron armar el rompecabezas utilizando datos de Franklin & # 8217 y piezas clave de información sobre el emparejamiento de nucleótidos en una molécula de ADN. En 1953, tanto Wilkins como Franklin publicaron artículos sobre sus datos de rayos X en el mismo Naturaleza problema con el artículo de Watson y Crick # 8217 sobre la estructura del ADN. Franklin murió de cáncer en 1958, y aunque la investigación de Franklin sobre los virus fue apreciada durante su vida, sus contribuciones al descubrimiento de la estructura del ADN fueron ampliamente reconocidas póstumamente. En 1962, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Watson, Crick y Wilkins por resolver la estructura del ADN.

ADN, o ácido desoxirribonucleico, es el material hereditario en humanos y casi todos los demás organismos. Casi todas las células del cuerpo de una persona tienen el mismo ADN. La mayor parte del ADN se encuentra en el núcleo celular (donde se le llama ADN nuclear ), pero también se puede encontrar una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias (donde se llama ADN mitocondrial o ADNmt). El complemento completo de ADN de una célula se llama su genoma. Normalmente, las moléculas de ADN son moléculas de doble cadena, lineales, filiformes unidas con proteínas en el núcleo de cada célula. Se estima que las moléculas de ADN de una sola célula humana estiradas de un extremo a otro miden alrededor de 6 pies de largo.

La información en el ADN se almacena como un código compuesto por cuatro bases químicas: adenina (A), guanina (GRAMO), citosina (C) y timina (T). El ADN humano consta de aproximadamente 3 mil millones de bases, y más del 99% de esas bases son iguales en todas las personas. El orden o secuencia de estas bases determina la información disponible para construir y mantener un organismo, similar a la forma en que las letras del alfabeto aparecen en un cierto orden para formar palabras y oraciones.

Las bases de ADN se emparejan entre sí, adenina con timina (A-T) y citosina con guanina (C-G), para formar unidades llamadas pares de bases. Cada base también está unida a una molécula de azúcar y una molécula de fosfato. Juntos, una base, azúcar y fosfato se denominan nucleótido. Los nucleótidos están dispuestos en dos hebras largas que forman una escalera en espiral llamada doble hélice. La estructura de escalera de la doble hélice se forma con los pares de bases como peldaños y las moléculas de azúcar-fosfato como piezas laterales verticales (Figura 2.12).

Una propiedad importante del ADN es que cumple dos funciones: replicarse o hacer copias de sí mismo y producir proteínas. Durante replicación (Figura 2.13), cada hebra de ADN en la doble hélice puede servir como patrón para duplicar la secuencia de bases. Esto es fundamental cuando las células se dividen porque cada nueva célula necesita tener una copia exacta del ADN presente en la célula vieja. La replicación del ADN comienza con la separación de los enlaces que mantienen unidos los pares de bases en la hebra madre, creando dos hebras plantilla.

Figura 2.12: Diferentes estructuras químicas de ADN y ARN.

Figura 2.13: Proceso de replicación del ADN que da como resultado dos moléculas de ADN completas.

Las bases no apareadas en las hebras de la plantilla se atraen y se unen con nucleótidos libres complementarios en direcciones opuestas. Cuando se forman todos los nuevos pares de bases en cada hebra, la replicación se completa y ahora hay dos moléculas de ADN completas.

Hay un segundo ácido nucleico en todas las células llamado ácido ribonucleico, o ARN (Figura 2.12). Al igual que el ADN, el ARN está formado por nucleótidos que incluyen una base, azúcar y fosfato. Los nucleótidos de ARN contienen las bases químicas adenina, citosina y guanina, pero no contienen timina, que en su lugar se reemplaza por uracilo (U). Además, el ARN existe como una molécula monocatenaria en lugar de una hélice bicatenaria. Esta molécula juega un papel clave en el transporte de aminoácidos para la construcción de cadenas de proteínas durante la síntesis de proteínas.

Durante la producción de proteínas, las bases de ARN se organizan en secuencias de tres, que se denominan codones. Estas secuencias determinan el ensamblaje de diferentes aminoácidos. Por ejemplo, la combinación y disposición de timina, adenina y guanina codifican el aminoácido isoleucina, que ayuda a reconstruir el tejido muscular. Los aminoácidos se unen en cadenas para producir diferentes proteínas, que son compuestos químicos necesarios para la estructura y los procesos operativos de las células del cuerpo. Hay 20 aminoácidos diferentes que pueden unirse en diferentes combinaciones y cantidades para producir millones de proteínas diferentes básicas para la vida.


Fondo

Maíz (Zea mays) es uno de los cultivos más plantados del mundo, utilizado para el consumo humano, la alimentación animal y como materia prima para biocombustibles y otros productos (revisado en [1]). Además de su importancia agrícola, el maíz es una planta modelo para la genética de cultivos de monocotiledóneas, con secuencias genómicas completas de B73 [2] y otros 34 genomas de maíz depositados en Maize Genetics and Genomics Database (maizeGDB.org). Sin embargo, se encuentran disponibles pocas herramientas genómicas para fenotipar los impactos de genes individuales. La transformación del maíz es técnicamente difícil, costosa y requiere mucho tiempo (revisado en [3]). Por tanto, las alternativas a la transformación de transgénicos estables son valiosas. Las herramientas basadas en virus desarrolladas para el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) de alto rendimiento podrían ayudar a llenar el vacío para los estudios de la función genética del maíz.

Se han desarrollado muchos virus vegetales como herramientas beneficiosas para la expresión de proteínas o VIGS (revisado en [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]). VIGS se ha utilizado para análisis funcionales de genes en plantas hospedadoras [11,12,13,14], utilizando fragmentos de genes diana en vectores virales en orientaciones sentido o antisentido o estructuras de horquilla (ver ejemplos en [15]), con fragmentos de secuencia de inserción como tan pequeño como 100-300 nt es eficaz para silenciar los genes diana [13]. Los virus de plantas también se han utilizado ampliamente para la expresión de proteínas en muchas especies de plantas diferentes (revisado en [5, 16, 17, 18]). En un caso, incluso se desarrolló un vector de virus vegetal derivado del virus del moteado de la vaina de frijol (BPMV) para la expresión simultánea de un solo gen y el silenciamiento de un solo gen [19]. Para el maíz, se han desarrollado varios virus como herramientas para la expresión o silenciamiento de genes, incluido el virus del mosaico del bromo (BMV) [20, 21], el virus del mosaico del pepino (CMV) [13] y el virus del rayado fino del maíz (MRFV) [22]. para el silenciamiento de genes [23], virus del mosaico de la estría del trigo (WSMV) [24, 25, 26] y virus del mosaico de la caña de azúcar [27] para la expresión de proteínas, virus del mosaico de la cola de zorra (FoMV) para el silenciamiento de genes [28] o expresión de proteínas [29] y guía de entrega de ARN para la edición de genes CRISPR / Cas9 [30], virus del mosaico de rayas de cebada para silenciamiento génico [23] o expresión de proteínas [31] o para guía de entrega de ARN [32] y virus del mosaico estriado amarillo de cebada (BYSMV) para guía simultánea ARN y expresión de proteínas de alta capacidad de carga [33].

Virus en la familia Potyviridae, o potyvirus, se han desarrollado como vectores de expresión de genes heterólogos en varias plantas hospedantes, lo que permite el seguimiento del movimiento del virus y otros experimentos. Virus en la familia Potyviridae tienen partículas de virus flexibles en forma de bastón con un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo encapsulado por la proteína de la cubierta viral, y son el grupo más grande de virus de plantas (revisado en [34]). El genoma del potyvirus codifica una poliproteína que es escindida por sus propias proteasas virales para producir 10 proteínas virales funcionales maduras para la replicación del virus, patogenicidad, transmisión de pulgones y otras funciones a través de la interacción con muchas proteínas vegetales hospedantes (revisado en [34]). Los potyvirus desarrollados para la expresión de proteínas incluyen el virus del grabado del tabaco (TEV) [35, 36], el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) [37], el virus de la viruela de la ciruela (PPV) [38], el virus A de la patata (PVA) [39,40, 41], virus del mosaico del nabo (TuMV) [42, 43], virus del mosaico de las bandas de las venas del tabaco (TVBMV) [44], WSMV [24] y SCMV [27]. Debido a su fuerte supresor del silenciamiento, los potyvirus no fueron favorecidos para el desarrollo de vectores VIGS, sin embargo, el PVA fue desarrollado para el silenciamiento transitorio de genes [45]. Los sitios de inserción más comunes en estos vectores basados ​​en potyvirus son las uniones de secuencia codificadora de P1 / HCPro y NIb / CP, con otros cuatro sitios de unión en el marco de lectura abierto de poliproteína (ORF) o en el extremo 5 'del ORF de poliproteína utilizado en algunos vectores.

Dado que se puede utilizar más de un sitio de inserción de secuencia para algunos potyvirus, y sus viriones expandibles en forma de bastón son generalmente más tolerantes a las secuencias de inserción que los virus con viriones icosaédricos y restricciones de empaquetamiento inherentes, se ha demostrado la expresión de dos a cinco proteínas de un solo vector. logrado en algunos de estos sistemas [36, 41,42,43].

Dadas las características de los potyvirus y el interés en otras herramientas para el maíz, el virus del mosaico enano del maíz (MDMV) fue una opción atractiva para el desarrollo. El MDMV se informó por primera vez en Ohio en 1963 [46]. El MDMV es transmitido naturalmente por los pulgones de una manera no persistente [47], y es fácilmente transmisible por inoculación por frotamiento en el laboratorio [48]. Las plantas infectadas con MDMV tienen síntomas de mosaico en las hojas de cultivares de maíz susceptibles que pueden ser visibles tan pronto como 5-7 días después de la inoculación por frotamiento. El MDMV es común en los Estados Unidos y es capaz de reducir los rendimientos, pero el mejoramiento exitoso de la resistencia y el manejo de enfermedades tienen una pérdida importante de rendimiento limitada (revisado en [49]). Además del maíz, el rango de hospedantes de MDMV incluye algunos cultivares de sorgo y Johnsongrass (Sorgo halepense L.), que es un importante reservorio de virus de hibernación [50, 51]. Se informó previamente la secuencia de consenso casi completa de un aislado MDMV OH2 mantenido en laboratorio (nº de acceso de GenBank JQ403609) y la secuencia completa de un clon infeccioso derivado (nº de acceso de MDMV OH1 GenBank JQ403608) de Ohio [52]. Aquí informamos sobre la clonación y secuenciación de un nuevo aislamiento de MDMV de Ohio de Johnsongrass, MDMV OH5, el desarrollo de clones infecciosos de MDMV OH5 y construcciones diseñadas para la expresión génica simultánea y el silenciamiento de múltiples genes en maíz. Divulgamos el primer desarrollo de un vector basado en virus para la expresión génica simultánea y VIGS multiobjetivo en maíz.


RESULTADOS

Acoplamiento de la transcripción con la detección de ARN

A continuación, presentamos la impresión basada en S HERLOCK de in vitro t ranscription (SPRINT) y mostrar cómo esta metodología puede medir las concentraciones de varias moléculas efectoras y superar las limitaciones de los métodos existentes. En una reacción isotérmica, de un solo paso y de un lote, Cas13a se dirige a un sitio de ARN que se transcribe a partir de una plantilla de ADN. Como Cas13a no escinde el ADN, solo detectará su secuencia objetivo cuando se transcriba como ARN. Posteriormente, Cas13a escinde oligonucleótidos de pentauridina marcados con fluorescencia, produciendo una señal fluorescente. Este ensayo se utilizó para cuantificar la activación o represión de la transcripción en diversas condiciones. Debido a que la transcripción puede ser regulada por aTF o riboswitches de una manera dependiente de ligando, SPRINT puede usarse para cuantificar esos ligandos en muestras con una salida fluorométrica (Figura 1D).

Optimización y evaluación comparativa de SPRINT

Como prueba de principio, el riboswitch sintético sensible a la guanina bien descrito xpt/pbuE* Se utilizó 6U (30) para establecer las condiciones de reacción para detectar la transcripción con Cas13a. los xpt/pbuE* 6U contiene el dominio aptámero del B. subtilis xpt-pbuX riboswitch que responde al ligando guanina y algunos compuestos relacionados como la hipoxantina (61, 62). los xpt aptámero está acoplado al pbuE *Plataforma de expresión 6U, que se deriva de la B. subtilis pbuE riboswitch que responde a la adenina (63). La nomenclatura de aptámero/plataforma de expresión para riboswitches quiméricos se utilizará a lo largo del manuscrito. En ausencia de guanina, el terminador intrínseco dentro del xpt / pbuE* El riboswitch 6U hace que la ARN polimerasa interrumpa la síntesis en presencia de guanina, se sintetizan transcripciones de lectura completa que pueden ser detectadas por Cas13a.

Poner en pares in vitro transcripción y detección de ARN mediada por Cas13a, se tuvieron que establecer las condiciones del ensayo para una reacción que es isotérmica, de un solo paso y de un lote. Sin embargo, la combinación de los componentes de reacción a 37 ° C en tampón SHERLOCK (44) produjo una señal de fondo alta en ausencia de ligando (Figura 2A). Para superar este problema, probamos un tampón que se usó anteriormente para analizar riboswitches sintéticos (30), denominado tampón SPRINT. El tampón SPRINT sin modificar redujo la señal de fondo y permitió la detección del ligando con una inducción de señal de 2,8 veces (Figura 2A). Para reducir aún más la señal de fondo, se evaluó la contribución de Cas13a a la señal de fondo. Las reacciones de SHERLOCK se ejecutaron en el búfer SPRINT y SHERLOCK (Figura 2B) y el ARN se pudo cuantificar de manera confiable en ambos búferes con una señal de fondo insignificante (Figura complementaria S1a). Esto indica que los componentes SHERLOCK funcionan de manera eficiente en el búfer SPRINT y en su lugar in vitro la transcripción debe ser el foco para optimizar el rango dinámico del ensayo SPRINT.

Optimización de condiciones y benchmarking de señal. Todas las mediciones de fluorescencia se corrigieron con el fondo, las barras indican el valor medio y las barras de error indican la s.d. de la media n = 3. Todas las medidas se normalizaron a fluoresceína 125 nM. (A) Las reacciones SPRINT se llevaron a cabo con el riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U en búfer SPRINT o búfer SHERLOCK. La transcripción del ARN diana fue regulada por el riboswitch en respuesta a ± 100 µM de hipoxantina. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 minutos de tiempo de reacción. (B) Las reacciones de SHERLOCK se llevaron a cabo en tampón SHERLOCK o tampón SPRINT a concentraciones variables de ARN diana añadido. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 min de tiempo de reacción. (CD) Las reacciones SPRINT se llevaron a cabo con el riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U con concentraciones variables de rNTP y plantilla de transcripción. La fluorescencia se midió en respuesta a ± 10 µM de guanina a los 25 minutos de tiempo de reacción. (mi) Las reacciones SPRINT fueron reguladas por el riboswitch de guanina xpt/pbuE* 6U en respuesta a ± 10 μM de guanina. Se realizaron ensayos de recambio único con 66 μg / ml de heparina, se realizaron ensayos de recambio múltiples sin heparina.

Optimización de condiciones y benchmarking de señal. Todas las mediciones de fluorescencia se corrigieron con el fondo, las barras indican el valor medio y las barras de error indican la s.d. de la media n = 3. Todas las mediciones se normalizaron a fluoresceína 125 nM. (A) Las reacciones SPRINT se llevaron a cabo con el riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U en búfer SPRINT o búfer SHERLOCK. La transcripción del ARN diana fue regulada por el riboswitch en respuesta a ± 100 µM de hipoxantina. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 minutos de tiempo de reacción. (B) Las reacciones de SHERLOCK se llevaron a cabo en tampón SHERLOCK o tampón SPRINT a concentraciones variables de ARN diana añadido. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 min de tiempo de reacción. (CD) Las reacciones SPRINT se llevaron a cabo con el riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U con concentraciones variables de rNTP y plantilla de transcripción. La fluorescencia se midió en respuesta a ± 10 µM de guanina a los 25 minutos de tiempo de reacción. (mi) Las reacciones SPRINT fueron reguladas por el riboswitch de guanina xpt/pbuE* 6U en respuesta a ± 10 μM de guanina. Se realizaron ensayos de recambio único con 66 μg / ml de heparina, se realizaron ensayos de recambio múltiples sin heparina.

El tampón SPRINT se alteró sistemáticamente para identificar condiciones mejoradas (Figura complementaria S1B). El tampón SPRINT está basado en Tris, mientras que el tampón SHERLOCK está basado en HEPES y cuando se usa HEPES en lugar de tampón Tris para las reacciones SPRINT, se abolió la supresión de la señal en ausencia de ligando. Esto indica que la ausencia de HEPES en el búfer SPRINT es esencial para permitir la terminación de la transcripción por parte del xpt / pbuE *Riboswitch de 6U. Debido a que la albúmina de suero bovino (BSA) no afectó al ensayo, se eliminó del tampón (Figura complementaria S1C) para disminuir el riesgo de contaminación por ARNasa de las preparaciones de BSA. Dado que muchas moléculas pequeñas hidrófobas de interés potencial no se pueden disolver en agua, pero sí en DMSO, la respuesta de las reacciones SPRINT también se midió en cantidades crecientes de DMSO (Figura complementaria S1D). Aunque el DMSO aumenta ligeramente tanto el fondo como la señal, las concentraciones finales de DMSO al 10% no inhibieron el ensayo. Sin embargo, la mayoría de los cambios en la composición del tampón SPRINT dieron como resultado ningún cambio o una disminución en la detección de la transcripción de lectura directa inducida por ligando (Figura complementaria S1B).

Para optimizar aún más tanto la intensidad de la señal como el tiempo de reacción, se alteró sistemáticamente la concentración de NTP y plantilla de ADN en la reacción SPRINT. Las concentraciones más bajas de ADN y NTP dieron como resultado el mayor cambio cuando se indujo la lectura de la transcripción con guanina (Figura 2C). Sin embargo, debido a que estas condiciones condujeron a señales relativamente débiles (Figura 2D), decidimos comprometer una inducción de mayor número de veces para señales más fuertes y elegimos una plantilla de ADN de 2,5 nM y NTP 20 μM para permitir una detección de señal fiable en un tiempo de reacción de 20 minutos. Este tampón SPRINT modificado (Figura 2A) se usa en todos los experimentos de este estudio, a menos que se indique lo contrario. Dado que las concentraciones de NTP y la plantilla de ADN tienen un fuerte efecto sobre la inducibilidad y la velocidad de la señal, pueden considerarse parámetros principales para optimizar y adaptar los ensayos SPRINT.

El efecto de la heparina sobre SPRINT se evaluó porque in vitro Los ensayos de transcripción generalmente contienen heparina para restringir la ARN polimerasa a un solo recambio de transcripción. Ensayos SPRINT con el xpt/pbuE* Se probó el riboswitch de guanina 6U con y sin heparina (Figura 2E). La represión de la señal de fondo es más eficaz en los ensayos de recambio único con heparina, pero la señal inducida en los ensayos de recambio múltiple fue aproximadamente 35 veces mayor y alcanzó su máximo aproximadamente dos veces más rápido. Esto muestra que la transcripción de recambio múltiple es principalmente responsable de la fuerza de la señal fluorescente en contraposición a las reacciones de recambio múltiple de la enzima Cas13a. Esta observación es consistente con resultados previos que mostraron que la amplificación de la entrada de ARN es necesaria para una señal SHERLOCK fuerte (44, 45). Por esta razón, la mayoría de los ensayos SPRINT se realizaron sin heparina, pero tenga en cuenta que SPRINT se puede ejecutar como un ensayo de recambio único siempre que se prefiera una señal de fondo mínima a una respuesta rápida.

Para evaluar su sensibilidad, la reacción SPRINT se comparó con el método estándar de oro de cuantificar los productos de transcripción mediante la separación de las transcripciones de ARN marcadas con 32 P mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (58). La respuesta transcripcional del riboswitch de guanina xpt/pbuE* 6U y el riboswitch de adenina pbuE/pbuE ‡ (64) a su ligando respectivo se midió mediante SPRINT y el método de radiomarcaje (Figura 3A, B). los T50 El valor, la concentración de ligando a la mitad de la activación máxima de la transcripción, se obtuvo de un ajuste a los datos y se usó para comparar los métodos. Para ambos riboswitches, el T50 fue similar entre SPRINT de recambio múltiple, radiomarcaje de recambio único y valores de la literatura que también se obtuvieron con el radiomarcaje de recambio único. Esto indica que los resultados obtenidos con SPRINT son comparables a los obtenidos con el radiomarcaje al tiempo que aumentan la velocidad, la facilidad y el rendimiento de los ensayos de transcripción. Juntos, estos datos establecen que hemos combinado eficazmente la regulación transcripcional dependiente de moléculas pequeñas y la detección de ARN mediada por Cas13a en una sola reacción.

Respuesta a la dosis de varios riboswitches medidos con SPRINT. Todas las mediciones de fluorescencia se corrigieron con el fondo, las barras indican el valor medio y las barras de error indican la s.d. de la media norte = 3. (A, B) Las respuestas del riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U y el riboswitch de adenina pbuE / pbuE ‡ a sus ligandos afines se midieron. Los resultados de las mediciones de SPRINT están marcados en azul, los resultados de las mediciones de radiomarcaje están marcados en rojo. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 min de tiempo de reacción. Se midieron las respuestas de varios riboswitches a sus ligandos afines y compuestos químicamente similares: (C) un riboswitch sensor SAM, (D) un riboswitch sensor de flavina mononucleótido, (mi) un riboswitch sensor de fluoruro (señal medida a los 60 minutos), y (F) un riboswitch sensor de serotonina. (GRAMO) El nativo asignar El riboswitch sensor de SAM es un interruptor de APAGADO y atenúa la transcripción con concentraciones crecientes de ligando. Se añadió heparina a 66 µg / ml. Señal de la asignar la reacción se midió a los 100 minutos de tiempo de reacción. * (30), # (68), ‡ (23), § (73), † (31).

Respuesta a la dosis de varios riboswitches medidos con SPRINT. Todas las mediciones de fluorescencia se corrigieron con el fondo, las barras indican el valor medio y las barras de error indican la s.d. de la media norte = 3. (A, B) Las respuestas del riboswitch de guanina xpt / pbuE* 6U y el riboswitch de adenina pbuE / pbuE ‡ a sus ligandos afines se midieron. Los resultados de las mediciones de SPRINT están marcados en azul, los resultados de las mediciones de radiomarcaje están marcados en rojo. Las medidas mostradas se tomaron a los 20 min de tiempo de reacción. Se midieron las respuestas de varios riboswitches a sus ligandos afines y compuestos químicamente similares: (C) un riboswitch sensor SAM, (D) un riboswitch sensor de flavina mononucleótido, (mi) un riboswitch sensor de fluoruro (señal medida a los 60 minutos), y (F) un riboswitch sensor de serotonina. (GRAMO) El nativo asignar El riboswitch sensor de SAM es un interruptor de APAGADO y atenúa la transcripción con concentraciones crecientes de ligando. Se añadió heparina a 66 µg / ml. Señal de la asignar la reacción se midió a los 100 minutos de tiempo de reacción. * (30), # (68), ‡ (23), § (73), † (31).

SPRINT se puede implementar con varios riboswitches

Para probar la versatilidad y especificidad de SPRINT, se evaluó la detección de otras moléculas pequeñas e iones a través de riboswitches. El riboswitch de adenina pbuE/pbuE ‡ respondió selectivamente a la adenina pero no a la guanina (Figura 3B). los S-adenosilmetionina (SAM)-riboswitch sensible yitJ/pbuE* 6U detectó SAM pero no el compuesto relacionado S-adenosilhomocisteína (SAH), como se esperaba (30). los T50 El valor de SAM fue comparable a las mediciones anteriores utilizando el ensayo de marcado con 32 P (Figura 3C). El riboswitch del mononucleótido de flavina (FMN) ribD/pbuE* Se observó que el riboswitch 7U tiene una respuesta de alta afinidad a FMN con un T50 valor alrededor de 1,01 ± 0,03 μM, una respuesta de baja afinidad al dinucleótido de flavina adenina (FAD) estrechamente relacionado (30, 65), y ninguna respuesta al ribocil, que es un agonista selectivo de los relacionados ribB riboswitch (66, 67) (Figura 3D). Esto concuerda con los resultados publicados (30, 65–67). Los cuatro riboswitches (xpt/pbuE* 6U, pbuE/pbuE ‡ , yitJ/pbuE* 6U y ribD/pbuE* 7U) son sintéticos con variaciones del pbuE plataforma de expresión (30), destacando la utilidad de los riboswitches artificiales como biosensores robustos.

Ocasionalmente, las condiciones de reacción debían optimizarse para adaptarse a nuevos riboswitches. La inducción dependiente de ligando del riboswitch FMN fue inicialmente muy débil. Para mejorar esto, se incrementó la concentración de magnesio en la reacción SPRINT. De los cuatro riboswitches que se probaron a niveles más altos de MgCl2 concentraciones, solo las ribD riboswitch mostró un aumento significativo en la inducción de veces (Figura complementaria S2). Por lo tanto, las reacciones de SPRINT con el ribD/pbuE* El riboswitch de 7U se realizó a 10 mM de MgCl.2 en lugar de 2,5.

Algunos ligandos inhibieron el ensayo SPRINT cuando se agregaron a altas concentraciones. El riboswitch de flúor crcB activa la lectura completa de la transcripción respondiendo selectivamente al fluoruro. Usando el ensayo SPRINT, medimos un T50 valor de 11 ± 1 μM (Figura 3E), que es, sorprendentemente, más bajo de lo observado anteriormente KD valores de ∼60 μM resultantes del sondeo en línea (68). Esto puede explicarse en parte por una inhibición observada del ensayo a concentraciones de fluoruro por encima de 100 µM. Para comprender si este efecto inhibitorio se debe a la inhibición de la E. coli Las reacciones RNAP o inhibición de Cas13a, SHERLOCK se llevaron a cabo a concentraciones variables de fluoruro de sodio. Cas13a se inhibió gradualmente con el aumento de las concentraciones de fluoruro y la señal se redujo drásticamente ∼600 μM (Figura complementaria S3A). Para medir la respuesta de E. coli RNAP a fluoruro, se desarrolló un protocolo de dos lotes (Figura complementaria S3B) para transcribir primero ARN en presencia de fluoruro, luego lavar el fluoruro y agregar las transcripciones lavadas a una reacción SHERLOCK. La transcripción inducida por fluoruro del riboswitch de fluoruro de manera lineal hasta concentraciones de 100 μM, pero concentraciones superiores a 125 μM de fluoruro redujo drásticamente la actividad transcripcional general (Figura complementaria S3C). Esto sugiere que E. coli El propio RNAP es el componente más sensible al fluoruro en las reacciones SPRINT. Estudios con crcB cepas de knockout de E. coli apoyan estos hallazgos al mostrar una inhibición significativa del crecimiento cuando las concentraciones de fluoruro en los medios exceden los 100 μM (68). Estos resultados muestran cómo se puede utilizar el ensayo de dos pasos para separar in vitro reacciones de transcripción de reacciones de Cas13a o potencialmente para eliminar compuestos inhibidores de Cas13a después de la transcripción que de otra manera interferirían con el ensayo.

Los aptámeros de ARN novedosos se generan de forma rutinaria a través de la e volución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) contra compuestos de interés (23, 69-71) y la incorporación de tales aptámeros sintéticos en SPRINT puede expandir enormemente su repertorio de biosensores. Previamente se incorporó a la plataforma de expresión un aptámero sintético que se une al 5-hidroxitriptófano (5HTP) (23) pbuE’Para generar un conmutador ON-riboswitch que responda tanto al 5HTP como a la serotonina (R). Este riboswitch, llamado P1 /pbuE'7U, se utilizó con SPRINT para detectar con éxito la serotonina. los T50 El valor se midió como 5 ± 3 µM para la serotonina y el riboswitch discriminó contra el compuesto relacionado triptamina (Figura 3F). Sorprendentemente, la serotonina inhibió tanto la transcripción como la reacción de Cas13a a concentraciones & gt100 μM, mientras que compuestos similares como el 5HTP no causaron efectos inhibidores (Figura complementaria S3D-F). Por esta razón, la curva de dosis-respuesta mostrada debe interpretarse con precaución ya que los efectos inhibidores distorsionan la señal a concentraciones ∼100 μM. A pesar de la inhibición idiosincrásica por la serotonina, estos resultados demuestran cómo las plataformas de expresión se pueden combinar con aptámeros sintéticos de una manera plug-and-play para crear nuevos biosensores para la plataforma SPRINT.

SPRINT puede evaluar rápidamente la función de riboswitch nativa

Todos los riboswitches descritos en este estudio hasta ahora son interruptores 'ON' que inducen la transcripción en presencia de ligandos (30, 31, 68, 72) y, por lo tanto, están predispuestos a funcionar bien en el contexto del ensayo SPRINT, mientras que la mayoría de los riboswitches nativos son ' OFF 'interruptores. Para evaluar si SPRINT puede monitorear de manera robusta los interruptores de APAGADO, examinamos el asignar riboswitch de B. subtilis que aborta la transcripción en respuesta a SAM (73). La secuencia nativa de riboswitch se amplificó a partir del B. subtilis genoma mediante PCR y en un segundo paso de PCR el tac el promotor se añadió al extremo 5 'y la transcripción de la diana Cas13a al extremo 3' de modo que el producto de PCR resultante pudiera usarse directamente como molde de ADN para SPRINT (Figura complementaria S4A). Inicialmente, se requerían concentraciones muy altas de SAM para reprimir la señal (Figura complementaria S4B). Para evitar este problema, se agregó heparina al ensayo SPRINT para restringir la ARN polimerasa a un solo recambio de transcripción. Aunque la reacción se ralentizó, la sensibilidad del ensayo mejoró enormemente. Titular SAM produjo una T50 valor de alrededor de 1 μM (Figura 3G), que es similar a los valores previamente establecidos de 0.5 y 2 μM (31, 73). Esto demuestra que los riboswitches ON y OFF se pueden integrar en una plantilla de ADN para SPRINT.

SPRINT puede detectar moléculas pequeñas a través de proteínas represoras transcripcionales

Los métodos desarrollados previamente utilizan factores de transcripción alostéricos (aTF) para detectar compuestos. Jung et al. (54) desarrollaron un sistema llamado ROSALIND que detecta compuestos con aTF para regular la transcripción impulsada por T7 RNAP de un aptámero de unión a fluoróforo (74) y, por lo tanto, produce una salida fluorométrica (Figura 1A). De esta manera, se detectaron 16 compuestos diversos, entre ellos tetraciclinas, macrólidos, moléculas pequeñas e iones metálicos. Para incorporar el amplio repertorio de biosensores aTF en SPRINT, exploramos las condiciones que permiten una reacción isotérmica, de un solo lote y de un paso que detecta compuestos con aTF y genera una señal a través de Cas13a.

El tampón ROSALIND se adoptó para reacciones SPRINT basadas en aTF, aunque se hicieron algunas modificaciones al tampón para optimizar la sensibilidad y la velocidad de la reacción. La enzima pirofosfatasa inorgánica (IPPasa) se consideró innecesaria y se eliminó del tampón ROSALIND. Otras adaptaciones incluyen reducir las concentraciones de rNTP de 2,85 mM a 40 µM, molde de ADN de 25 a 15 nM y T7 RNAP de 10 a 6,7 ​​ng / µl.

Usando el tampón y las condiciones adaptados, se midieron las respuestas de los represores TetR y SmtB con SPRINT. El represor SmtB permitió la transcripción de una manera dependiente de zinc con un T50 de 4.8 ± 0.3 μM y mostró una alta selectividad contra el cobre (Figura 4A). El represor TetR respondió a concentraciones crecientes de anhidrotetraciclina con un T50 de 1,9 ± 0,2 μM que está dentro del rango de 1 a 2,5 μM medido previamente (54) (Figura 4B). Esto muestra que SPRINT no solo puede medir la regulación de E. coli RNAP por riboswitches, pero también regulación de T7 RNAP por factores de transcripción. La combinación de estos dos mecanismos de detección de ligandos amplía enormemente el alcance de las moléculas que pueden detectarse con SPRINT.

Regulación de la transcripción por factores de transcripción. La señal fluorescente de las reacciones SPRINT se midió a los 20 minutos de tiempo de reacción. Se restó el fondo y se normalizó la señal a fluoresceína 125 nM. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. (A) SmtB desreprime la transcripción en respuesta al zinc, pero no al cobre. (B) TetR desreprime la transcripción en respuesta a la anhidrotetraciclina. * (54).

Regulación de la transcripción por factores de transcripción. La señal fluorescente de las reacciones SPRINT se midió a los 20 minutos de tiempo de reacción. Se restó el fondo y la señal se normalizó a fluoresceína 125 nM. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. (A) SmtB desreprime la transcripción en respuesta al zinc, pero no al cobre. (B) TetR desreprime la transcripción en respuesta a la anhidrotetraciclina. * (54).

SPRINT puede cribar compuestos en un formato de alto rendimiento

Existe un interés creciente en la drogadicción de estructuras de ARN (75-79), incluidos objetivos como el elemento TAR del VIH (80), repeticiones de expansión humana (75, 81) o riboswitches (82-85), pero desarrollando plataformas para detección de alto rendimiento. de las interacciones ARN-fármaco sigue siendo un desafío. Como prueba de concepto, la respuesta del riboswitch de guanina xpt/pbuE* Se midieron de 6U a 30 moléculas orgánicas pequeñas diferentes en un formato de cribado de alto rendimiento (Figura 5A, Figura complementaria S5A). Para todos los compuestos, la señal SPRINT a alta concentración se representó frente a la señal a baja concentración para visualizar la relación dosis-respuesta para cada compuesto. Las concentraciones exactas y los nombres completos de los compuestos se pueden encontrar en la Tabla complementaria S3. Los compuestos como la guanina que provocaron una activación transcripcional igualmente fuerte a concentraciones bajas y altas se encuentran en el cuadrante superior derecho del gráfico y se espera que sean agonistas fuertes de la diana. Compuestos como norteSe espera que la 2-metilguanina que se encuentra en el cuadrante superior izquierdo tenga menos actividad agonista hacia la diana de ARN. Compuestos no aglutinantes como norteLa 6-metiladenina se encuentra en el cuadrante inferior izquierdo. Se sospecha que los compuestos como la 7-deazaguanina que mostraron cierta activación de la transcripción a concentraciones bajas pero una activación reducida o nula a concentraciones altas inhiben el ensayo a concentraciones más altas. En particular, los resultados de esta selección son consistentes con informes anteriores sobre la unión de compuestos individuales al xpt dominio aptámero utilizando enfoques de ITC o footprinting (61, 86–89). Por lo tanto, la selección de compuestos con SPRINT nos permitió evaluar rápidamente el efecto de varios compuestos en el ARN objetivo para encontrar compuestos de interés.

SPRINT se puede utilizar para análisis de compuestos y ensayos acoplados a enzimas. La señal fluorescente de las reacciones SPRINT se restó de fondo y se normalizó a fluoresceína 125 nM. (A) El riboswitch de guanina xpt / pbuE* Transcripción regulada por 6U en respuesta a 30 compuestos diferentes. La señal con disolvente solo se restó de la señal con ligando para corregir las diferencias en los disolventes de los ligandos. Los puntos representan el valor medio, norte = 3. (B) Se midió el efecto de los compuestos sobre la transcripción de un promotor constitutivo. La señal con disolvente solo se restó de la señal con ligando para corregir las diferencias en los disolventes de los ligandos. Los puntos representan una réplica biológica. (C) SPRINT midió la transcripción constitutiva de la diana Cas13a a medida que la transcripción se inhibía a concentraciones crecientes de rifampicina. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. (D) Diagrama de un ensayo acoplado a enzimas. La enzima hPNP convierte la inosina en hipoxantina, que es detectada por el riboswitch de guanina. xpt / pbuE* 6U y activa la señal SPRINT. (mi) El ensayo acoplado a enzimas se utilizó para medir la actividad enzimática de hPNP. La concentración de inosina fue 1 mM, se añadió hPNP a una actividad de 10 mU / µl, la concentración de Immucilina-H fue 10 µM. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. pag-el valor se calculó utilizando un método de dos colas t-prueba. (F) Se utilizó el ensayo de enzima acoplada para medir la conversión de sustrato dependiente de la concentración. Se añadió hPNP a una actividad de 1 mU / µl. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3.

SPRINT se puede utilizar para análisis de compuestos y ensayos acoplados a enzimas. La señal fluorescente de las reacciones SPRINT se restó de fondo y se normalizó a fluoresceína 125 nM. (A) El riboswitch de guanina xpt / pbuE* Transcripción regulada por 6U en respuesta a 30 compuestos diferentes. La señal con disolvente solo se restó de la señal con ligando para corregir las diferencias en los disolventes de los ligandos. Los puntos representan el valor medio, norte = 3. (B) Se midió el efecto de los compuestos sobre la transcripción de un promotor constitutivo. La señal con disolvente solo se restó de la señal con ligando para corregir las diferencias en los disolventes de los ligandos. Los puntos representan una réplica biológica. (C) SPRINT midió la transcripción constitutiva de la diana Cas13a a medida que la transcripción se inhibía a concentraciones crecientes de rifampicina. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. (D) Diagrama de un ensayo acoplado a enzimas. La enzima hPNP convierte la inosina en hipoxantina, que es detectada por el riboswitch de guanina. xpt / pbuE* 6U y activa la señal SPRINT. (mi) El ensayo acoplado a enzimas se utilizó para medir la actividad enzimática de hPNP. La concentración de inosina fue 1 mM, se añadió hPNP a una actividad de 10 mU / µl, la concentración de Immucilina-H fue 10 µM. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3. pag-el valor se calculó utilizando un método de dos colas t-prueba. (F) Se utilizó el ensayo de enzima acoplada para medir la conversión de sustrato dependiente de la concentración. Se añadió hPNP a una actividad de 1 mU / µl. Las barras indican el valor medio, las barras de error indican la s.d. de la media. norte = 3.

Al realizar el cribado de fármacos inhibidores de la diana, es fundamental identificar de forma fiable los compuestos de interferencia de ensayo (DOLORES) (90) que podrían aparecer como falsos positivos. Para este propósito, el panel de fármacos se probó en reacciones SPRINT que transcriben constitutivamente una diana Cas13a sin componentes reguladores como riboswitches o aTF. Esta configuración solo mide los efectos de los compuestos en el análisis del núcleo. De esta forma, compuestos como la 7-deazaguanina, norteLa 2-metilguanina, la 2,5,6-triaminpirimidin-4-ona (2,5,6-TAP) y, en menor medida, la 2-fluoroadenina se pudieron identificar con éxito como compuestos que interfieren en el ensayo (Figura 5B, S5B complementario, Tabla complementaria S3).

Los estudios anteriores tenían como objetivo identificar nuevos antibióticos dirigidos a la maquinaria transcripcional de las bacterias (91, 92). Esto puede incluir riboswitches dirigidos (66, 82-84, 93), factores de transcripción (94, 95) o la ARN polimerasa misma (96, 97). La rifampicina inhibe el RNAP bacteriano (98) al bloquear el alargamiento (99) y es el fármaco principal para tratar infecciones por micobacterias como la tuberculosis (100). Medimos el efecto inhibidor de la rifampicina sobre el RNAP con SPRINT. Se tituló una reacción de transcripción constitutiva con diferentes concentraciones de rifampicina (Figura 5C). A T50 Se obtuvo un valor de 5,9 ± 0,6 nM, muy cercano al establecido KD de 3 nM (101). Esto demuestra cómo se puede utilizar SPRINT para detectar fármacos que se dirijan a la transcripción y cuantificar rápidamente la eficacia del fármaco.

Ensayo de enzimas acopladas

SPRINT puede generar señales fluorescentes rápidas en respuesta a varios compuestos y, por lo tanto, podría usarse para detectar productos de reacciones enzimáticas. La mayoría de los ensayos acoplados a enzimas se limitan a la detección de un metabolito en particular, como el ADP generado en una reacción de quinasa o el NADH generado en una reacción redox (102). La detección de productos enzimáticos con un riboswitch o factor de transcripción es una alternativa atractiva debido a la gran diversidad de compuestos que se pueden detectar con estos sistemas. Examinamos la purina nucleósido fosforilasa humana (hPNP) (103, 104), parte de la vía de recuperación de purina, que cataliza la fosforilación de la fracción ribosa de varios nucleósidos de purina y la eliminación simultánea del azúcar de la nucleobase y evaluamos las condiciones para una isoterma, Ensayo SPRINT acoplado a enzimas de un solo lote y un paso.

La conversión de inosina en hipoxantina por hPNP se acopló al riboswitch de guanina sintética xpt/pbuE* 6U (Figura 5D). El riboswitch de guanina responde a la hipoxantina (30) pero no se une a nucleósidos como la inosina. Este ensayo acoplado a enzimas permitió la observación de la actividad enzimática por la enzima hPNP (Figura 5E) sin cambiar ningún componente del tampón SPRINT, excepto agregar los sustratos inosina y fosfato (Figura complementaria S6). La titulación de la reacción acoplada con inosina mostró un aumento dependiente de la concentración de la producción de hipoxantina por la enzima hPNP (Figura 5F). La conversión de desoxiguanosina en guanina por hPNP se puede inhibir con análogos de nucleósidos como Immucilina-H (forodesina) que conduce a la acumulación de desoxiguanosina y la consiguiente apoptosis en las células T activadas. Por lo tanto, la hPNP es un importante objetivo farmacológico para el tratamiento de la leucemia, la artritis, la esclerosis múltiple y el rechazo de trasplantes (105-111). La adición del inhibidor competitivo Immucilina-H a una concentración 100 veces menor que el sustrato inosina provocó una reducción significativa en la actividad enzimática medida en el ensayo SPRINT (Figura 5E). Juntos, estos resultados demuestran cómo se puede utilizar SPRINT para evaluar la actividad de las enzimas, medir la inhibición de dichas enzimas con fármacos y detectar indirectamente compuestos como la inosina que no se unen a los aTF ni a los riboconmutadores.

Formatos de ensayo portátiles

Para abordar la necesidad de dispositivos de diagnóstico en el lugar de atención, SPRINT debe ser adaptable a dispositivos portátiles como ensayos de flujo lateral (LFA) (45, 112) o dispositivos fluorométricos portátiles (37, 54, 113, 114). Anteriormente se desarrolló un dispositivo portátil y económico que se puede fabricar con una impresora 3D para detectar contaminantes del agua mediante fluorescencia (54). Este dispositivo portátil ilumina los tubos de reacción con luz azul ∼470 nm y las sondas fluorescentes se pueden ver a través de una película amarilla utilizada como filtro óptico de paso largo. La fluorescencia de las reacciones SPRINT fue fácilmente visible para el ojo humano usando el dispositivo y no se requirieron adaptaciones excepto el aumento de la concentración de ARN marcado con FAM en las reacciones SPRINT a 1,25 µM (Figura complementaria S7). Con el riboswitch de fluoruro, se pueden diferenciar a simple vista diferentes concentraciones de fluoruro después de 20 minutos de tiempo de reacción (Figura 6A) a 30 ° C, lo que se puede lograr fácilmente sujetando firmemente los tubos en la mano. Además, el factor de transcripción sensible al zinc SmtB se utilizó para detectar zinc en muestras de agua municipal que se recolectaron, filtraron y enviaron desde Paradise, California, donde los niveles de zinc se vieron afectados por Camp Fire 2018 (54) (Figura 6B). Al comparar la fluorescencia de las muestras con una curva de calibración, la concentración de zinc de las muestras podría aproximarse a simple vista en alrededor de 0-1 μM (I), 2.5-5 μM (II) y ∼5 μM (III), respectivamente. . La concentración de zinc en las muestras de agua municipal se determinó previamente mediante espectroscopía de absorción atómica de llama (FAAS) (54) para su comparación. Estos resultados demuestran que SPRINT se puede adaptar a formatos portátiles económicos y muestra cómo el ensayo podría usarse para pruebas de campo.

Detección de analitos con un dispositivo de mano. Los ensayos SPRINT se ensamblaron y se agregaron a muestras de agua que contenían concentraciones variables del analito. Las concentraciones indicadas se refieren a la concentración final de analito después de mezclar la muestra con los componentes del ensayo. Después de mezclar la muestra y los componentes del ensayo, los tubos se colocaron en el dispositivo LED y se tomaron fotografías inmediatamente después (0 min). Las diferentes apariencias de las muestras fluorescentes en A y B se deben a variaciones de la luz ambiental cuando se tomaron las fotografías. (A) Las reacciones SPRINT se realizaron con fluoruro riboswitch crcB. (B) Las reacciones SPRINT se realizaron con el factor de transcripción SmtB que responde al zinc. Las cinco reacciones de la izquierda contenían ddH2O con ZnCl añadido2. Las tres reacciones de la derecha etiquetadas como I, II y III contenían muestras de agua municipal de Paradise, California.

Detección de analitos con un dispositivo de mano. Los ensayos SPRINT se ensamblaron y se agregaron a muestras de agua que contenían concentraciones variables del analito. Las concentraciones indicadas se refieren a la concentración final de analito después de mezclar la muestra con los componentes del ensayo. Después de mezclar la muestra y los componentes del ensayo, los tubos se colocaron en el dispositivo LED y se tomaron fotografías inmediatamente después (0 min). Las diferentes apariencias de las muestras fluorescentes en A y B se deben a variaciones de la luz ambiental cuando se tomaron las fotografías. (A) Las reacciones SPRINT se realizaron con fluoruro riboswitch crcB. (B) Las reacciones SPRINT se realizaron con el factor de transcripción SmtB que responde al zinc. Las cinco reacciones de la izquierda contenían ddH2O con ZnCl añadido2. Las tres reacciones de la derecha etiquetadas como I, II y III contenían muestras de agua municipal de Paradise, California.


Información de soporte

S1 Fig. Ubicación y condiciones climáticas de los sitios de recolección de accesiones.

(A) Distribución de las 44 accesiones naturales utilizadas en este estudio. El color de los puntos representa el gradiente altitudinal. El mapa está sombreado siguiendo el gradiente de temperatura. (B) Precipitación media anual y temperatura media anual para los sitios donde se recolectaron las accesiones, en relación con los principales tipos de biomas del mundo según la clasificación de Whittaker. 1–9: Tundra, bosque boreal, desierto de pastizales templados, matorrales arbolados, bosque templado, bosque lluvioso templado, bosque tropical Savana, bosque tropical lluvioso y desierto. (C) Relación de indicadores climáticos y de altitud en los sitios de recolección.

S2 Fig. Tasa de expansión de roseta de 39 A. thaliana accesiones en condiciones de control a 8 h de duración del día.

Las barras son la media ± IC del 95% de la tasa de expansión de la roseta (mm 2 d -1) a los 30 días después de la inoculación (n = 3) de plantas cultivadas en condiciones de inoculación simulada: bien regadas.

S3 Fig. Medias de mínimos cuadrados para masa seca sobre el suelo siguiendo ANOVA de 39 A. thaliana accesiones cultivadas bajo una infección viral contrastada y niveles de riego.

La masa seca aérea se ha transformado logarítmicamente antes del análisis. Las barras son lsmedias ± IC del 95%. para plantas cultivadas bajo cuatro tratamientos: simulacros de inoculación: WW, CaMV infectados: WW, simulacros de inoculación: WD e infectados por CaMV: condiciones de WD. WW: bien regado WD: déficit hídrico. Los datos son del Experimento 1.

S4 Fig. Relación entre el cambio relativo de la masa seca aérea (ADM) de 39 A. thaliana accesiones en respuesta a la infección por CaMV y al déficit hídrico.

Cada punto representa el cambio relativo medio de cada accesión. Los colores de los puntos se refieren a los diferentes grupos de respuesta determinados en la figura 1. Las líneas continuas representan regresiones lineales significativas: (A) r = 0.39, PAG = 0.015 (B) r = 0.41 PAG = 0,003. Las líneas discontinuas representan la línea de identidad (1: 1), es decir, la línea de respuesta igual. Los datos son del Experimento 1. WW: condiciones de buen riego WD: déficit hídrico.

S5 Fig. Relación entre la puntuación R y el cambio relativo de la masa seca aérea (%) en respuesta a la infección por CaMV y el déficit de agua para cinco grupos de respuesta.

Cada punto representa un grupo de respuesta como se determina en la Fig. 1. Las plantas fueron infectadas con CaMV o simuladas de inoculación en condiciones de buen riego (WW) y déficit de agua (WD) Los colores son similares a los grupos de respuesta I-IV en la Fig 1. Las líneas representan regresiones lineales significativas.

S6 Fig. Efectos de la infección por CaMV y el riego sobre la masa foliar por área (LMA) de 39 A. thaliana accesiones.

(A) Las barras son medias ± 95% CI de la masa foliar por área (LMA mg mm -2) a 30 dpi (n = 3) de plantas cultivadas en: WW (barras blancas), infectadas por CaMV: WW ( barras de color gris oscuro), con inoculación simulada: WD (barras de color gris claro) e infectada con CaMV: condiciones de WD (barras negras). (B) Cambio relativo (± se) de LMA (%) en simulacros de inoculación: WW (círculo blanco), infectados por CaMV: WW (triángulo gris oscuro), simulacros de inoculación: WD (diamante gris claro) e infectados por CaMV : Condiciones WD (cuadrado negro). Los datos son del Experimento 1.

S7 Fig. Efectos de la infección por CaMV y el riego sobre el contenido de materia seca de las hojas (LDMC) de 39 A. thaliana accesiones.

(A) Las barras son medias ± 95% CI del contenido de materia seca de la hoja (LDMC mg g -1) a 30 dpi (n = 3) de plantas cultivadas en: WW (barras blancas), infectadas por CaMV: WW ( barras de color gris oscuro), con inoculación simulada: WD (barras de color gris claro) e infectada con CaMV: condiciones de WD (barras negras). (B) Cambio relativo (± se) de LDMC (%) en simulacros de inoculación: WW (círculo blanco), infectados por CaMV: WW (triángulo gris oscuro), simulacros de inoculación: WD (diamante gris claro) e infectados por CaMV : Condiciones WD (cuadrado negro). Los datos son del Experimento 1.

S8 Fig. Comparación de las relaciones entre LMA y LDMC y las tasas de crecimiento inherentes a la duración del día de 8 h y la duración del día de 12 h.

(A) Relación entre la masa foliar por área (LMA mg mm -2) y el contenido de materia seca de la hoja (LDMC mg g -1) en el experimento 1. (B) Relación entre LMA y LDMC en el experimento 2. Cada punto representa la media relativa cambio de cada genotipo. Las líneas representan regresiones lineales significativas (PAG & lt 0,001). Inoculado de forma simulada: WW (círculo blanco), infectado por CaMV: WW (triángulo gris oscuro), inoculado de forma simulada: WD (diamante gris claro) e infectado por CaMV: WD (cuadrado negro). Los datos son del Experimento 1 y 2 (n = 39, duración del día de 8 horas yn = 20, duración del día de 12 horas, respectivamente). (C) Relación entre la tasa de expansión (mm 2 d -1) a las 8 horas y a las 12 horas del día 15 A. thaliana accesionesr = 0,71, P = 0,003).

S9 Fig. Relación entre el crecimiento vegetativo y los rasgos morfológicos foliares de 39 A. thaliana accesiones.

Cada punto representa una accesión en condiciones de riego abundante (círculo azul oscuro WW) o de déficit hídrico (triángulo azul claro WD). (A) Relación entre el cambio relativo de la producción de masa seca aérea (ADM%) en plantas infectadas con CaMV y el contenido de materia seca de la hoja (LDMC mg g -1 de Pearson r = –0.43, PAG & lt 0,007 para WW y r = –0.20, PAG = 0,23 para WD). (B) Relación entre el cambio relativo de ADM (%) en plantas infectadas por CaMV en WW y en WD y la masa foliar por área (LMA mg mm -2 r = –0.52, PAG & lt 0,001 para WW y r = –0.35, PAG = 0.031 para WD). Las líneas representan regresiones lineales significativas en PAG & lt 0,05. Los datos son del Experimento 1.

S10 Fig. Efectos de la infección por CaMV y el tratamiento con agua sobre los rasgos fenológicos de 20 A. thaliana accesiones.

(A) Días para atornillar. (B) Días para la floración. Las barras y las barras de error son medias ± intervalos de confianza del 95% bootstrap de plantas cultivadas con inoculación simulada: WW (barras blancas), inoculada simuladamente: WD (barras gris oscuro), infectadas con CaMV: WW (barras gris claro) y CaMV- infectado: condiciones de WD (barras negras). WW: condiciones de buen riego WD: déficit de agua Las accesiones se ordenan de acuerdo con su área final proyectada de la roseta en condición de infección viral. Los datos son del Experimento 2.

S11 Fig. Relaciones entre rasgos morfológicos foliares, ruderalidad y fenología de 20 accesiones de A. thaliana.

Relaciones de los días con el brote vs. (A) contenido de materia seca de la hoja (LDMC mg g-1), (B) masa foliar por área (LMA mg mm-2) y (C) puntaje ruderal (R%) y días a la floración frente a (D) LDMC, (E) LMA y (F) R. Cada punto representa una accesión cultivada bajo la condición de control (bien regado x simulacro de inoculación). Las líneas son regresiones lineales significativas en PAG & lt 0,05. Los datos son del Experimento 2.

S12 Fig. Dinámica de los síntomas virales en 20 accesiones de A. thaliana infectados con CaMV en condiciones de buen riego y déficit hídrico.

(A) Tiempo de retraso de aparición de los síntomas. (B) Tasa de aparición de síntomas. Las barras y las barras de error son medias ± intervalos de confianza del 95% extraídos del ajuste de la curva sigmoidea de la dinámica de los síntomas en condiciones de buen riego (barras grises) y déficit de agua (barras negras). Las marcas sobre las barras indican una disminución significativa (-) o un aumento (+) a nivel del 5% en respuesta al déficit de agua. Las accesiones se ordenan de acuerdo con el aumento del área proyectada final de la roseta. Los datos son del Experimento 2.



Comentarios:

  1. Togul

    Se consigue el mayor número de puntos. Creo que este es un concepto muy diferente. Totalmente de acuerdo con ella.

  2. Kinsley

    estas son las fotos ya seria hora!!!!



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