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¿Cómo se dividen las células del neuroblastoma? ¿Es por mitosis?

¿Cómo se dividen las células del neuroblastoma? ¿Es por mitosis?


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Mi nombre es Daniel y tengo 17 años. Actualmente estoy diseñando un estudio para investigar compuestos que potencialmente aumentan la replicación de las células neuronales. Usaré células de neuroblastoma y crearé diferentes medios a base de agua para aplicar a estas células. Sin embargo, no entiendo cómo se dividen. ¿Es a través de la mitosis o se replican de una manera diferente, ya que son esencialmente células cancerosas?


¿Qué es la mitosis?

¿Alguna vez se preguntó cómo se repara su piel cuando se raspa la rodilla? ¿O cómo un bebé se convierte en adulto? Estos complicados procesos comienzan a nivel microscópico, en sus células.

Las células son seres vivos. Llevan a cabo funciones vitales mientras están vivos. Y eventualmente se rompen y mueren.

Cada tipo de célula tiene una vida útil diferente. Algunos, como los glóbulos blancos, viven menos de un día. Otras, como las neuronas de tu cerebro, ¡pueden sobrevivir toda tu vida! Pero la mayoría de las células de su cuerpo deben ser reemplazadas en algún momento.


Cohesin se abre a la división celular

Científicos de la Universidad de Nagoya, con colegas de la Universidad de Kyoto en Japón, han descubierto un mecanismo que permite que un complejo de proteínas se una al ADN sin impedir algunos de los procesos importantes de la división celular. Sus hallazgos, publicados en la revista Informes de celda, podría mejorar la comprensión de los trastornos del desarrollo que surgen de mutaciones en el gen que codifica el complejo.

El ADN se condensa durante la división celular para formar estructuras llamadas cromosomas que están formadas por dos copias idénticas, llamadas cromátidas hermanas. Estas cromátidas hermanas están unidas por proteínas llamadas cohesinas, hasta que llega el momento de separarlas y dirigirlas hacia las células recién formadas. Los científicos saben bastante sobre la estructura y las funciones de la cohesina, pero quedan algunas preguntas. Por ejemplo, la unión de cohesina a los cromosomas debería constituir un impedimento estructural para el proceso de replicación del ADN, entonces, ¿por qué no es así?

"Descubrimos que el anillo de cohesina necesita abrirse para que ciertos procesos, como la replicación del ADN, progresen", dice el biólogo cromosómico de la Universidad de Nagoya, Tomoko Nishiyama, quien dirigió el estudio.

Cohesin es un complejo en forma de anillo que consta de cuatro subunidades que pueden unirse de varias formas para formar anillos más pequeños. Los investigadores encontraron que la molécula transportadora de energía ATP desencadena la apertura de uno de los anillos. Esto facilita la replicación progresiva de la doble hélice del ADN.

Además, los científicos descubrieron que este anillo debe abrirse para que ocurran otros dos procesos: uno que involucra la segregación cromosómica durante la división celular y otro que involucra la formación de bucles de ADN. El bucle de ADN hace que los segmentos que están lejos unos de otros se acerquen, lo cual es importante para regular la expresión génica.

"Básicamente, la cohesina debe ser dinámica en el ADN para que ocurran estos procesos", dice Nishiyama. "Los cambios en la forma de las cohesinas afectan la estructura del genoma, y ​​las deficiencias en esta función pueden causar enfermedades genéticas relacionadas con las cohesinas llamadas cohesinopatías".

A continuación, el equipo quiere comprender mejor los mecanismos moleculares de la participación de la cohesina en la replicación del ADN. También quieren mejorar la comprensión de las cohesinopatías investigando cómo la cohesina regula la estructura del genoma.


Resultados

Las células Neuro-2a extienden procesos similares a axones y dendritas

Se seleccionaron células Neuro-2a para el presente estudio porque son mitóticas y extienden procesos cortos durante la interfase. Las células experimentan aproximadamente dos divisiones mitóticas por día. Los procesos cortos generalmente se retraen hacia el cuerpo celular cuando la célula entra en la mitosis. A medida que se completa la mitosis, las células hijas se aplanan un poco y prolongan procesos cortos en aproximadamente el mismo patrón que la célula madre (Solomon, 1979). La morfología cambia gradualmente con divisiones mitóticas adicionales, lo que resulta en una gran heterogeneidad morfológica dentro de la cultura. Los procesos de interfase son generalmente más cortos de 50 μm y se pueden clasificar en dos categorías según su morfología (ver Materiales y métodos). Algunos tienen la forma cilíndrica delgada característica de los axones (Fig.1,A) y otros que tienen una forma cónica más gruesa similar a las dendritas (Fig.1,B). Estudios previos han documentado que estos procesos similares a axones y dendritas también son similares a los axones y dendritas genuinos con respecto a sus características ultraestructurales (Ross et al., 1975). En particular, existe una clara demarcación entre el citoplasma del cuerpo celular y el de los procesos similares a axones, con pocos o ningún ribosoma que ingresen a los procesos similares a axones. Por el contrario, no existe una demarcación clara entre el citoplasma del cuerpo celular y el de los procesos dendríticos, con ribosomas presentes en todas partes. Una celda individual puede mostrar uno o ambos tipos de procesos. En un conjunto típico de cultivos, examinamos 491 células. El 19% de estas células estaban procesadas. De todos los procesos extendidos por estas células, el 58% eran similares a axones, el 39% eran similares a las dendritas y el 3% eran ambiguos. Las longitudes promedio de estos procesos fueron respectivamente 36 ± 17, 37 ± 17 y 25 ± 5 μm (ver Tabla I).

Como se informó anteriormente, un tratamiento durante la noche con db cAMP o ácido retinoico hizo que las células dejaran de dividirse y promueve el desarrollo del proceso (Prasad et al., 1971 Shea et al., 1985 Fischer et al., 1986). El tratamiento con db cAMP suprimió la formación de procesos similares a dendrita y promovió la formación de procesos similares a axones (Fig.1,C). De 234 células examinadas en un conjunto de cultivos tratados con db cAMP, el 36% eran portadores del proceso. El 88% de los procesos eran similares a axones, el 5% eran similares a dendritas y el 7% eran ambiguos. Las longitudes promedio de estos procesos, respectivamente, fueron 73 ± 52, 39 ± 12 y 37 ± 15 μm. El tratamiento con ácido retinoico promovió la formación de procesos similares a dendrita (Fig.1,D). De 365 células examinadas en un conjunto de cultivos tratados con ácido retinoico, el 35% eran portadores de proceso. El 27% de los procesos eran similares a axones, el 65% eran similares a dendritas y el 8% eran ambiguos. Las longitudes promedio de estos procesos, respectivamente, fueron 41 ± 27, 56 ± 32 y 30 ± 17 μm (ver Tabla I).

Estudios previos documentaron que los procesos similares a axones y dendritas son similares a los axones y dendritas genuinos con respecto a características ultraestructurales como la distribución de ribosomas y características bioquímicas como la distribución de MAP2 y tau (Shea et al., 1985 Fischer et al. , 1986). Para determinar si estos procesos también muestran los patrones de polaridad de microtúbulos uniformes y no uniformes característicos de axones y dendritas, usamos el método estándar de "gancho" para la determinación de la polaridad de microtúbulos (ver Materiales y métodos). En este método, las células se extraen en presencia de tubulina cerebral exógena en un tampón de ensamblaje de microtúbulos especial que promueve la formación de láminas de protofilamentos laterales en los microtúbulos existentes. Cuando se ven en sección transversal, las hojas aparecen como apéndices en forma de gancho en los microtúbulos. Un gancho en el sentido de las agujas del reloj observado desde la punta del proceso indica que el microtúbulo está orientado con su extremo positivo distal al cuerpo celular, mientras que un gancho en el sentido contrario a las agujas del reloj indica lo contrario. El número de microtúbulos dentro de una sección transversal individual tomada en la región media de los procesos varió de 25 a 200, y los procesos similares a las dendritas mostraron consistentemente un mayor número de microtúbulos que los procesos similares a los axones. El porcentaje de estos microtúbulos que mostraron ganchos interpretables fue superior al 75%. Cinco procesos similares a axones de células en interfase normales mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (97 ± 3%, ver Fig.2,A), mientras que ocho procesos similares a dendrita mostraron niveles altos de ganchos en sentido horario (58 ± 5%) y antihorario (42 ± 5% ver Fig.2,B). Cinco procesos similares a dendrita de cultivos tratados con ácido retinoico mostraron niveles altos de ganchos en sentido horario (46 ± 13%) y antihorario (56 ± 9% ver Fig.2,C). Cinco procesos similares a axones de células tratadas con db cAMP mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (98 ± 2% ver Fig.2,D). Cinco procesos similares a axones de cultivos tratados con ácido retinoico mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (97 ± 2% no mostrado). Estos datos, resumidos en la Tabla II, indican que los patrones de polaridad de microtúbulos uniformes y no uniformes apropiados de axones y dendritas genuinos se establecen dentro de los procesos de tipo axón y dendrita extendidos por células en interfase normales y en células postmitóticas con db cAMP o ácido retinoico.

CHO1 / MKLP1 se redistribuye durante la formación del proceso

Si el motor mitótico CHO1 / MKLP1 juega un papel en la formación del proceso, esperaríamos que su expresión continúe a medida que la célula se vuelve posmitótica. Los análisis de transferencia Northern indican que el motor se expresa en células mitóticas, como se esperaba, y también que la expresión continúa en células tratadas con db cAMP o ácido retinoico (ver Fig.3,A). De manera similar a nuestra experiencia previa con células mitóticas (Sellitto y Kuriyama, 1988), tuvimos dificultades para detectar la proteína en transferencias Western. Las razones de esto no están claras, pero aparentemente se relacionan con factores distintos a la baja abundancia de CHO1 / MKLP1 dentro de estas células (Kuriyama, R., observaciones no publicadas). Debido a esta dificultad, utilizamos inmunofluorescencia cuantitativa para analizar los niveles y la distribución de la proteína CHO1 / MKLP1 con estas células. Inicialmente, nuestra atención se centró en las células mitóticas para determinar si el anticuerpo monoclonal utilizado anteriormente en las células de ovario de hámster chino reconoce eficazmente CHO1 / MKLP1 en células de neuroblastoma de ratón. La distribución del etiquetado fue completamente similar a la informada para CHO y otros tipos de células mitóticas. La tinción se concentró a lo largo de los microtúbulos de cada medio husillo durante la metafase (no se muestra), en la región de la zona media durante la anafase (Fig.3,B) y dentro del cuerpo residual durante la telofase (Fig.3 C).

Habiendo obtenido estos resultados como control positivo, dirigimos nuestra atención a las células portadoras del proceso. En las células en interfase normales, la tinción para CHO1 / MKLP1 era difusa dentro del cuerpo celular, a veces también aparecía en los núcleos. Esto contrasta con las células en interfase no neuronales típicas en las que la tinción generalmente se concentra solo en el centrosoma y el núcleo. En las células del neuroblastoma, la tinción también se extendió a los procesos similares a dendrita. La tinción fue especialmente alta en el tercio más proximal a la mitad de los procesos y luego disminuyó con la distancia del cuerpo celular (Fig.4,A). Este patrón también se mostró por los procesos similares a dendrita extendidos en presencia de ácido retinoico (Fig.4,B). Por el contrario, los procesos similares a axones de las células en interfase normales (Fig.4,C), células tratadas con ácido retinoico (Fig.4,B flecha) y las células tratadas con db cAMP (Fig.4 D) no mostraron prácticamente tinción.

La Fig. 5 muestra datos derivados de análisis de inmunofluorescencia cuantitativos sobre los niveles totales de CHO1 / MKLP1 en células en interfase normal, células que sufren mitotis, células tratadas con ácido retinoico y células tratadas con cAMP. Los niveles eran estadísticamente indistinguibles entre las células en interfase normales y las células sometidas a mitotis, pero mostraron un aumento dramático en la presencia de ácido retinoico y una disminución dramática en la presencia de cAMP (ver la leyenda de la figura para más detalles). Estos datos indican una correlación directa entre los niveles de CHO1 / MKLP1 y si las células generan o no procesos dendríticos.

La inhibición de la expresión de CHO1 / MKLP1 afecta la formación del proceso

El hecho de que CHO1 / MKLP1 se concentre dentro de los procesos similares a las dendritas es coherente con la idea de que podría desempeñar un papel en la diferenciación de estos procesos. Para probar esto, usamos oligonucleótidos antisentido para suprimir la expresión de CHO1 / MKLP1. Se fabricaron dos secuencias de oligonucleótidos antisentido de 19 bases diferentes que no se solapan correspondientes a sitios cercanos a la porción amino-terminal de la molécula. Como controles, también obtuvimos secuencias de oligonucleótidos con sentido correspondientes a ambas secuencias antisentido. Las secuencias, que se denominaron AS1, AS2, S1 y S2, se añadieron directamente al medio de cultivo a diversas concentraciones y se renovaron cada 6 h. A continuación, los cultivos se prepararon para análisis de inmunofluorescencia cuantitativos en niveles de CHO1 / MKLP1 cada 24 h hasta 72 h. Para probar la especificidad, también se prepararon cultivos para análisis cuantitativos de los niveles de β-tubulina, dineína citoplasmática y MAP2. MAP2 fue de particular interés porque es una proteína enriquecida con dendrita que puede tener un papel propio en la diferenciación dendrítica (véase, por ejemplo, Fischer et al., 1986). Para cada punto de datos, se seleccionaron al azar 100 celdas y se obtuvo la media ± DE para el grupo.

Se observaron efectos marcados sobre los niveles de CHO1 / MKLP1 en cultivos tratados con cualquiera de las secuencias antisentido. En las primeras 24 h en la concentración de 5 μM de AS1, los niveles de proteína se redujeron a & lt60% de los niveles de control y se redujeron aún más al 10-20% de los niveles de control a las 48 h. Cuando la concentración de antisentido se incrementó a 10 o 20 μM, los niveles de proteína se redujeron al 15-20% de los niveles de control, y se redujeron aún más a niveles indetectables a las 48 h. La secuencia antisentido de AS2 también dio como resultado niveles de proteína muy disminuidos, pero fue menos eficaz que AS1, incluso cuando se usó en concentraciones algo más altas. Ninguna de las secuencias sentido alteró de forma detectable los niveles de CHO1 / MKLP1. Ninguna de las secuencias antisentido y ninguna de las secuencias sentido dieron como resultado disminuciones en los niveles de β-tubulina, MAP2 o dineína citoplásmica. Estos resultados, mostrados en las Figs. 6 y 7, indican que las secuencias antisentido son efectivas para disminuir los niveles de CHO1 / MKLP1, y sugieren fuertemente que esta respuesta no se debe a efectos nocivos inespecíficos de los oligonucleótidos.

Dentro de las primeras 24 h en cualquiera de las secuencias antisentido, era evidente que el número de células en el cultivo no había aumentado, lo que sugiere que había cesado la división mitótica. Esta interpretación está respaldada por el hecho de que nunca se observaron células mitóticas en cultivos inmunoteñidos para tubulina o CHO1 / MKLP1. Los cultivos tratados con sentido fueron completamente similares a los controles con respecto a la proliferación celular y la aparición de perfiles mitóticos en cultivos inmunoteñidos. También se observaron efectos marcados sobre la morfología del proceso en los cultivos tratados con cualquiera de las secuencias antisentido pero ninguna de las secuencias con sentido (ver Fig. 7 y Tabla I). Específicamente, la formación de procesos similares a dendrita fue prácticamente eliminada en presencia de antisentido, incluso cuando el ácido retinoico también se incluyó en el cultivo. La disminución en el número de procesos similares a dendrita fue evidente a las 24 h en todas las concentraciones del antisentido. Para los análisis cuantitativos, utilizamos la concentración de 10 μm de AS1 durante 48 h, la concentración más baja y el período de tiempo para cualquiera de las dos secuencias antisentido que prácticamente borraron la tinción detectable de CHO1 / MKLP1. De las 416 células examinadas, el 26% eran portadoras de proceso. El 88% de los procesos eran similares a axones, el 10% eran ambiguos y solo el 2% eran similares a dendrita. En cultivos tratados con ácido retinoico y antisentido, el 36% de las 355 células eran portadoras de proceso. El 76% de los procesos eran similares a axones, el 22% eran ambiguos y solo el 2% eran similares a dendritas. La duración media de los procesos no fue notablemente diferente de la duración de los procesos de cultivos no tratados. Además, los cultivos tratados con sentido no fueron notablemente diferentes de los cultivos no tratados con respecto a ningún criterio morfológico. Figura 7,A muestra una cultura tratada con los sentidos con procesos predominantemente similares a las dendritas, mientras que la Fig.7,D muestra un cultivo tratado en antisentido con solo procesos similares a axones. Figura 7, B y mi muestran que los procesos similares a dendrita de cultivos tratados con sentido son inmunorreactivos para CHO1 / MKLP1, mientras que los procesos en los cultivos tratados con antisentido no lo son. Los cultivos enjuagados libres de antisentido o no rellenados con antisentido cada 6 h mostraron la reaparición de inmunorreactividad de CHO1 / MKLP1, actividad mitótica y procesos dendríticos en 24 h (datos no mostrados).

Estudios de polaridad de microtúbulos

Dadas las propiedades de CHO1 / MKLP1 en el huso mitótico, es razonable especular que el papel principal del motor durante la formación del proceso es establecer el patrón de polaridad de microtúbulos no uniforme de los procesos similares a dendrita. Para investigar esto, se evaluó la orientación de la polaridad de los microtúbulos en los procesos de las células tratadas con AS1 tanto en ausencia como en presencia de ácido retinoico. Dado que el tratamiento antisentido prácticamente elimina la formación de procesos con morfología similar a la dendrita, se eligieron al azar procesos de ocho células diferentes para los análisis de polaridad de microtúbulos. Todos estos procesos tenían una morfología similar a un axón. En los ocho procesos de cultivos tratados con antisentido que no fueron tratados con ácido retinoico, el 99 ± 1% de los ganchos fueron en el sentido de las agujas del reloj (Fig.7,F). En los ocho procesos de cultivos tratados con antisentido que también se trataron con ácido retinoico, el 97 ± 3% de los ganchos fueron en el sentido de las agujas del reloj. En cultivos tratados con S1, siete procesos similares a axones mostraron un 96 ± 2% de ganchos en el sentido de las agujas del reloj, y siete procesos similares a las dendritas mostraron un 59 ± 13% de ganchos en el sentido de las agujas del reloj (Fig.7 C). Estos análisis indican que el tratamiento antisentido, pero no el tratamiento sentido, compromete el establecimiento de matrices de microtúbulos orientadas no uniformemente dentro de los procesos de desarrollo.


Resultados

Las células Neuro-2a extienden procesos similares a axones y dendrita

Se seleccionaron células Neuro-2a para el presente estudio porque son mitóticas y extienden procesos cortos durante la interfase. Las células experimentan aproximadamente dos divisiones mitóticas por día. Los procesos cortos generalmente se retraen hacia el cuerpo celular cuando la célula entra en la mitosis. A medida que se completa la mitosis, las células hijas se aplanan un poco y prolongan procesos cortos en aproximadamente el mismo patrón que la célula madre (Solomon, 1979). La morfología cambia gradualmente con divisiones mitóticas adicionales, lo que resulta en una gran heterogeneidad morfológica dentro de la cultura.Los procesos de interfase son generalmente más cortos de 50 & # x003bcm y se pueden clasificar en dos categorías según su morfología (ver Materiales y métodos). Algunos tienen la forma cilíndrica delgada característica de los axones (Fig. & # X200B (Fig.1 1 A) y otros que tienen una forma cónica más gruesa similar a las dendritas (Fig. & # x200B (Fig.1 1 B). Estudios previos han documentado que estos procesos similares a axones y dendritas también son similares a los axones y dendritas genuinos con respecto a sus características ultraestructurales (Ross et al., 1975). En particular, existe una clara demarcación entre el citoplasma del cuerpo celular y el de los procesos similares a axones, con pocos o ningún ribosoma que ingresen a los procesos similares a axones. Por el contrario, no existe una demarcación clara entre el citoplasma del cuerpo celular y el de los procesos dendríticos, con ribosomas presentes en todas partes. Una celda individual puede mostrar uno o ambos tipos de procesos. En un conjunto típico de cultivos, examinamos 491 células. El 19% de estas células estaban procesadas. De todos los procesos extendidos por estas células, el 58% eran similares a axones, el 39% eran similares a las dendritas y el 3% eran ambiguos. Las longitudes medias de estos procesos fueron respectivamente 36 & # x000b1 17, 37 & # x000b1 17 y 25 & # x000b1 5 & # x003bcm (ver Tabla & # x200B TablaI). I ).

Micrografías de contraste de fase de células de neuroblastoma de ratón cultivadas. A y B muestran células normales en interfase que se extienden procesos similares a axones en A y procesos similares a dendrita en ANTES DE CRISTO muestra un proceso similar a un axón extendido por una célula en un cultivo tratado con db cAMP. D muestra procesos dendríticos extendidos por una célula en un cultivo tratado con ácido retinoico. Barra, 15 & # x003bcm.

Tabla I

Resumen de análisis morfométricos

Control Sentido (S1) Antisentido (AS1) Ácido retinoico (RA) RA + AS1 acampar
No de celdas (norte) 491 641 416 365 355 234
% de células
& # x02003procesos de soporte & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200919% & # x000a0 & # x000a0 & # x000a015% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200926% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200935% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200936% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200936%
% de procesos que
& # x02003son como dendrita & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200939% & # x000a0 & # x000a0 & # x000a044% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020092 & # x020092 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200965% & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020092% & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020095%
Promedio longitud (& # x003bcm) de
& # x02003procesos tipo dendrita 37 & # x000b1 17 48 & # x000b1 27 41 & # x000b1 12 56 & # x000b1 32 35 & # x000b1 13 29 & # x000b1 12
% de procesos que son
& # x02003 tipo axón & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200958% & # x000a0 & # x000a0 & # x000a051% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200988% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200927% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200976% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200988%
Promedio longitud (& # x003bcm) de
& # x02003 procesos similares a axones 36 & # x000b1 17 41 & # x000b1 13 46 & # x000b1 22 41 & # x000b1 27 46 & # x000b1 24 73 & # x000b1 52
% de procesos que
& # x02003son ambiguos & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020093% & # x000a0 & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020095% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200910% & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020098% & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x0200922% & # x000a0 & # x000a0 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x02009 & # x020097%
Promedio longitud (& # x003bcm) de
& # x02003procesos ambiguos 25 & # x000b1 5 36 & # x000b1 8 32 & # x000b1 3 30 & # x000b1 17 37 & # x000b1 17 37 & # x000b1 15

Como se informó anteriormente, un tratamiento durante la noche con db cAMP o ácido retinoico hizo que las células dejaran de dividirse y promueve el desarrollo del proceso (Prasad et al., 1971 Shea et al., 1985 Fischer et al., 1986). El tratamiento con db cAMP suprimió la formación de procesos similares a dendrita y promovió la formación de procesos similares a axones (Fig. & # X200B (Fig.1 1 C). De 234 células examinadas en un conjunto de cultivos tratados con db cAMP, el 36% eran portadores del proceso. El 88% de los procesos eran similares a axones, el 5% eran similares a dendritas y el 7% eran ambiguos. Las duraciones medias de estos procesos, respectivamente, fueron 73 & # x000b1 52, 39 & # x000b1 12 y 37 & # x000b1 15 & # x003bcm. El tratamiento con ácido retinoico promovió la formación de procesos similares a dendrita (Fig. & # X200B (Fig.1 1 D). De 365 células examinadas en un conjunto de cultivos tratados con ácido retinoico, el 35% eran portadores de proceso. El 27% de los procesos eran similares a axones, el 65% eran similares a dendritas y el 8% eran ambiguos. Las longitudes medias de estos procesos, respectivamente, fueron 41 & # x000b1 27, 56 & # x000b1 32 y 30 & # x000b1 17 & # x003bcm (ver Tabla & # x200B Tabla I I).

Estudios previos documentaron que los procesos similares a axones y dendritas son similares a los axones y dendritas genuinos con respecto a características ultraestructurales como la distribución de ribosomas y características bioquímicas como la distribución de MAP2 y tau (Shea et al., 1985 Fischer et al. , 1986). Para determinar si estos procesos también muestran los patrones característicos de polaridad de microtúbulos uniformes y no uniformes de axones y dendritas, utilizamos el método estándar & # x0201chooking & # x0201d de determinación de la polaridad de microtúbulos (ver Materiales y métodos). En este método, las células se extraen en presencia de tubulina cerebral exógena en un tampón de ensamblaje de microtúbulos especial que promueve la formación de láminas de protofilamentos laterales en los microtúbulos existentes. Cuando se ven en sección transversal, las hojas aparecen como apéndices en forma de gancho en los microtúbulos. Un gancho en el sentido de las agujas del reloj observado desde la punta del proceso indica que el microtúbulo está orientado con su extremo positivo distal al cuerpo celular, mientras que un gancho en el sentido contrario a las agujas del reloj indica lo contrario. El número de microtúbulos dentro de una sección transversal individual tomada en la región media de los procesos varió de 25 & # x02013200, con los procesos similares a dendrita mostrando consistentemente un mayor número de microtúbulos que los procesos similares a axones. El porcentaje de estos microtúbulos que mostraron ganchos interpretables fue superior al 75%. Cinco procesos similares a axones de células en interfase normales mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (97 & # x000b1 3% ver Fig. & # X200B Fig.2 2 A), mientras que ocho procesos similares a dendrita mostraron altos niveles de ganchos en sentido horario (58 & # x000b1 5%) y en sentido antihorario (42 & # x000b1 5% ver Fig. & # x200B Fig.2 2 B). Cinco procesos similares a dendrita de cultivos tratados con ácido retinoico mostraron niveles altos de ganchos en sentido horario (46 & # x000b1 13%) y en sentido antihorario (56 & # x000b1 9% ver Fig. & # X200B Fig.2 2 C). Cinco procesos similares a axones de células tratadas con db cAMP mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (98 & ​​# x000b1 2% ver Fig. & # X200B Fig.2 2 D). Cinco procesos similares a axones de cultivos tratados con ácido retinoico mostraron ganchos predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (97 & # x000b1 2% no se muestran). Estos datos, resumidos en la Tabla II, II, indican que los patrones de polaridad de microtúbulos uniformes y no uniformes apropiados de axones y dendritas genuinos se establecen dentro de los procesos similares a axones y dendríticas extendidos por células en interfase normales y en células procesadas postmitótico con db cAMP o ácido retinoico.

Análisis de polaridad de microtúbulos realizados en procesos extendidos por células de neuroblastoma. En los procesos similares a axones extendidos por las células en interfase normales, los apéndices en forma de gancho en los microtúbulos son predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (A). En los procesos similares a dendritas extendidos por estas células, proporciones aproximadamente iguales de los ganchos son en sentido horario y antihorario (B). En los procesos similares a dendrita extendidos en presencia de ácido retinoico, proporciones aproximadamente iguales de los ganchos son en sentido horario y antihorario (C). En los procesos similares a axones extendidos en presencia de db cAMP, los ganchos son predominantemente en el sentido de las agujas del reloj (D). Barra, 0.08 & # x003bcm.

Cuadro II

Resumen de análisis de polaridad de microtúbulos

Procesos similares a axones * Procesos similares a dendrita *
Control 97 & # x000b1 3% (norte = 5) & # x000a0 & # x02009 & # x0200958 & # x000b1 5% (norte = 8)
Sentido (S1) 96 & # x000b1 2% (norte = 7) 59 & # x000b1 13% (norte = 7)
Antisentido (AS1) 99 & # x000b1 1% (norte = 8) N / A
Ácido retinoico (RA) 97 & # x000b1 2% (norte = 5) 46 & # x000b1 13% (norte = 5)
RA + AS1 97 & # x000b1 3% (norte = 8) N / A
acampar 98 & # x000b1 2% (norte = 5) N / A

CHO1 / MKLP1 se redistribuye durante la formación del proceso

Si el motor mitótico CHO1 / MKLP1 juega un papel en la formación del proceso, esperaríamos que su expresión continúe a medida que la célula se vuelve posmitótica. Los análisis de transferencia Northern indican que el motor se expresa en células mitóticas, como se esperaba, y también que la expresión continúa en células tratadas con db cAMP o ácido retinoico (ver Fig. & # X200B Fig.3 3 A). De manera similar a nuestra experiencia previa con células mitóticas (Sellitto y Kuriyama, 1988), tuvimos dificultades para detectar la proteína en transferencias Western. Las razones de esto no están claras, pero aparentemente se relacionan con factores distintos a la baja abundancia de CHO1 / MKLP1 dentro de estas células (Kuriyama, R., observaciones no publicadas). Debido a esta dificultad, utilizamos inmunofluorescencia cuantitativa para analizar los niveles y la distribución de la proteína CHO1 / MKLP1 con estas células. Inicialmente, nuestra atención se centró en las células mitóticas para determinar si el anticuerpo monoclonal utilizado anteriormente en las células de ovario de hámster chino reconoce eficazmente CHO1 / MKLP1 en células de neuroblastoma de ratón. La distribución del etiquetado fue completamente similar a la informada para CHO y otros tipos de células mitóticas. La tinción se concentró a lo largo de los microtúbulos de cada medio husillo durante la metafase (no se muestra), en la región de la zona media durante la anafase (Fig. & # X200B (Fig. B) y dentro del cuerpo residual durante la telofase (Fig. & # x200B (Fig. C).

A muestra un análisis de transferencia Northern diseñado para detectar la presencia del mensaje CHO1 de 3,6 kb en cultivos de neuroblastoma. Se analizó el ARN mensajero de cultivos tratados con ácido retinoico (RA), db cAMP o con ninguno de los reactivos. Se encontraron niveles detectables de mensaje CHO1 en las tres condiciones. Aquí se muestra la condición de AR. B y C mostrar imágenes de inmunofluorescencia de células de neuroblastoma mitótico inmunoteñidas para tubulina (rojo) y CHO1 / MKLP1 (verde). B muestra una célula en anafase, con tinción CHO1 / MKLP1 concentrada en la zona media. C muestra una célula en telofase, con tinción CHO1 / MKLP1 concentrada en el medio del cuerpo. La tinción difusa para CHO1 / MKLP1 también está presente en todas las células. Barra, 5 & # x003bcm.

Habiendo obtenido estos resultados como control positivo, dirigimos nuestra atención a las células portadoras del proceso. En las células en interfase normales, la tinción para CHO1 / MKLP1 era difusa dentro del cuerpo celular, a veces también aparecía en los núcleos. Esto contrasta con las células en interfase no neuronales típicas en las que la tinción generalmente se concentra solo en el centrosoma y el núcleo. En las células del neuroblastoma, la tinción también se extendió a los procesos similares a dendrita. La tinción fue especialmente alta en el tercio más proximal a la mitad de los procesos y luego disminuyó con la distancia del cuerpo celular (Fig. & # X200B (Fig.4 4 A). Este patrón también se mostró por los procesos similares a dendrita extendidos en presencia de ácido retinoico (Fig. & # X200B (Fig.4 4 B). Por el contrario, los procesos similares a axones de las células normales en interfase (Fig. & # X200B (Fig.4 4 C), células tratadas con ácido retinoico (Fig. & # x200B (Fig.4 4 B flecha), y las células tratadas con db cAMP (Fig. & # x200B (Fig.4 4 D) no mostraron prácticamente tinción.

Análisis de inmunofluorescencia de la distribución de CHO1 / MKLP1 en células de neuroblastoma. La tinción se muestra en verde, mientras que la morfología celular se revela mediante superposiciones de las imágenes DIC (contraste de interferencia diferencial) de las células. A muestra procesos dendríticos de células en interfase normales. B muestra procesos similares a dendrita de cultivos tratados con ácido retinoico. Un proceso similar a un axón también es evidente en B, y está marcado con una flecha. C muestra procesos similares a axones extendidos por una célula en interfase normal. D muestra procesos similares a axones extendidos por células tratadas con db cAMP. En todos los casos, el citoplasma dentro del cuerpo celular se tiñe para CHO1 / MKLP1. En algunos casos, pero no en todos, la tinción nuclear también es evidente. En todos los casos, los procesos dendríticos se tiñen para CHO1 / MKLP1, con altos niveles de tinción proximalmente y niveles que disminuyen gradualmente con la distancia del cuerpo celular. Los procesos similares a axones prácticamente no muestran tinción para CHO1 / MKLP1. Barra, 10 & # x003bcm.

Fig. & # X200B La Fig. 5 muestra datos derivados de análisis de inmunofluorescencia cuantitativos sobre los niveles totales de CHO1 / MKLP1 en células en interfase normal, células que sufren mitotis, células tratadas con ácido retinoico y células tratadas con AMPc. Los niveles eran estadísticamente indistinguibles entre las células en interfase normales y las células sometidas a mitotis, pero mostraron un aumento dramático en la presencia de ácido retinoico y una disminución dramática en la presencia de cAMP (ver la leyenda de la figura para más detalles). Estos datos indican una correlación directa entre los niveles de CHO1 / MKLP1 y si las células generan o no procesos dendríticos.

Análisis de inmunofluorescencia cuantitativos sobre los niveles de CHO1 / MKLP1 dentro de las células del neuroblastoma en interfase (Enterrar), células sometidas a mitotis (Mito), células tratadas con ácido retinoico (REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES) y células tratadas con AMPc (acampar). Los niveles de proteína se midieron en unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU). Se examinaron diez células en cada condición, y se obtuvo una DE media & # x000b1 para cada condición. Análisis estadísticos utilizando los datos del alumno. t La prueba indica que no hay diferencia estadística entre las células mitóticas y en interfase (PAG & # x0003c 0,687), pero marcadas diferencias entre las células tratadas con ácido retinoico & # x02013 y las otras condiciones experimentales (PAG & # x0003c 0,001) y entre las células tratadas con AMPc y las otras condiciones experimentales (PAG & # x0003c 0,0005). Las células tratadas con ácido retinoico y # x02013 tenían niveles significativamente más altos de CHO1 / MKLP1 mientras que los cultivos tratados con cAMP tenían niveles significativamente más bajos de CHO1 / MKLP1.

La inhibición de la expresión de CHO1 / MKLP1 afecta la formación del proceso

El hecho de que CHO1 / MKLP1 se concentre dentro de los procesos similares a las dendritas es coherente con la idea de que podría desempeñar un papel en la diferenciación de estos procesos. Para probar esto, usamos oligonucleótidos antisentido para suprimir la expresión de CHO1 / MKLP1. Se fabricaron dos secuencias de oligonucleótidos antisentido de 19 bases diferentes que no se solapan correspondientes a sitios cercanos a la porción amino-terminal de la molécula. Como controles, también obtuvimos secuencias de oligonucleótidos con sentido correspondientes a ambas secuencias antisentido. Las secuencias, que se denominaron AS1, AS2, S1 y S2, se añadieron directamente al medio de cultivo a diversas concentraciones y se renovaron cada 6 h. A continuación, los cultivos se prepararon para análisis de inmunofluorescencia cuantitativos en niveles de CHO1 / MKLP1 cada 24 h hasta 72 h. Para probar la especificidad, también se prepararon cultivos para análisis cuantitativos en los niveles de & # x003b2-tubulina, dineína citoplásmica y MAP2. MAP2 fue de particular interés porque es una proteína enriquecida con dendrita que puede tener un papel propio en la diferenciación dendrítica (véase, por ejemplo, Fischer et al., 1986). Para cada punto de datos, se seleccionaron al azar 100 celdas y se obtuvo la media & # x000b1 SD para el grupo.

Se observaron efectos marcados sobre los niveles de CHO1 / MKLP1 en cultivos tratados con cualquiera de las secuencias antisentido. En las primeras 24 h en la concentración de 5 & # x003bcM de AS1, los niveles de proteína se redujeron al & # x0003c60% de los niveles de control y se redujeron aún más al 10 & # x0201320% de los niveles de control a las 48 h. Cuando la concentración de antisentido se incrementó a 10 o 20 & # x003bcM, los niveles de proteína se redujeron al 15 & # x0201320% de los niveles de control, y se redujeron adicionalmente a niveles indetectables a las 48 h. La secuencia antisentido de AS2 también dio como resultado niveles de proteína muy disminuidos, pero fue menos eficaz que AS1, incluso cuando se usó en concentraciones algo más altas. Ninguna de las secuencias sentido alteró de forma detectable los niveles de CHO1 / MKLP1. Ninguna de las secuencias antisentido y ninguna de las secuencias con sentido dieron como resultado disminuciones en los niveles de & # x003b2-tubulina, MAP2 o dineína citoplásmica. Estos resultados, mostrados en las Figs. & # x200B Las figuras 6, 6 y & # x200B y 7, 7 indican que las secuencias antisentido son eficaces para disminuir los niveles de CHO1 / MKLP1, y sugieren fuertemente que esta respuesta no se debe a efectos nocivos inespecíficos de los oligonucleótidos.

Análisis cuantitativos sobre los niveles de CHO1 / MKLP1 (izquierda dos paneles) y los niveles de tubulina, dineína y MAP2 (tres paneles a la derecha) en cultivos tratados con oligonucleótidos antisentido y sentido. Los niveles de proteína se determinaron usando microscopía de inmunofluorescencia cuantitativa y se expresaron en unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU). En estos análisis solo se puntuaron las células portadoras de procesos, y se analizaron 100 células para cada condición experimental y punto de tiempo. Las desviaciones estándar fueron generalmente bajas, del orden de 15 AFU, y no se pudieron incluir en el gráfico porque las barras de error serían cortas y borrosas juntas. Los tratamientos con AS1 y AS2 dieron como resultado una disminución de la tinción para CHO1 / MKLP1 de una manera dependiente de la dosis y del tiempo. Los controles sensoriales no afectaron los niveles de CHO1 / MKLP1. Ni los oligonucleótidos antisentido ni sentido dieron como resultado disminuciones en los niveles de & # x003b2-tubulina, dineína o MAP2.

Efectos de los oligonucleótidos con sentido y antisentido de CHO1 / MKLP1 sobre la morfología, la inmunofluorescencia de CHO1 / MKLP1 y la orientación de la polaridad de los microtúbulos. A & # x02013C son células tratadas con oligonucleótidos con sentido, mientras que D & # x02013F son células tratadas con oligonucleótidos antisentido. Las culturas tratadas con los sentidos eran completamente similares a los controles en el sentido de que mostraban muchos procesos similares a las dendritas (A) que se tiñó para CHO1 / MKLP1 (B) y contenía microtúbulos de ambas orientaciones (C). Los cultivos tratados con antisentido contenían casi exclusivamente procesos similares a axones (D). La tinción para CHO1 / MKLP1 prácticamente se borró de estos cultivos (mi), y los microtúbulos dentro de los procesos tenían una orientación de polaridad uniforme (F). Barras: (A, B, D, y mi) 20 & # x003bcm (C y F) 0,1 & # x003bcm.

Dentro de las primeras 24 h en cualquiera de las secuencias antisentido, era evidente que el número de células en el cultivo no había aumentado, lo que sugiere que había cesado la división mitótica. Esta interpretación está respaldada por el hecho de que nunca se observaron células mitóticas en cultivos inmunoteñidos para tubulina o CHO1 / MKLP1. Los cultivos tratados con sentido fueron completamente similares a los controles con respecto a la proliferación celular y la aparición de perfiles mitóticos en cultivos inmunoteñidos. También se observaron efectos marcados sobre la morfología del proceso en los cultivos tratados con cualquiera de las secuencias antisentido pero ninguna de las secuencias con sentido (ver Fig. & # X200B Fig. 7 7 y Tabla & # x200B Tabla I). I ). Específicamente, la formación de procesos similares a dendrita fue prácticamente eliminada en presencia de antisentido, incluso cuando el ácido retinoico también se incluyó en el cultivo. La disminución en el número de procesos similares a dendrita fue evidente a las 24 h en todas las concentraciones del antisentido. Para los análisis cuantitativos, utilizamos la concentración de 10 & # x003bcm de AS1 durante 48 h, la concentración más baja y el período de tiempo para cualquiera de las dos secuencias antisentido que prácticamente borraron la tinción detectable de CHO1 / MKLP1. De las 416 células examinadas, el 26% eran portadoras de proceso. El 88% de los procesos eran similares a axones, el 10% eran ambiguos y solo el 2% eran similares a dendrita. En cultivos tratados con ácido retinoico y antisentido, el 36% de las 355 células eran portadoras de proceso. El 76% de los procesos eran similares a axones, el 22% eran ambiguos y solo el 2% eran similares a dendritas. La duración media de los procesos no fue notablemente diferente de la duración de los procesos de cultivos no tratados. Además, los cultivos tratados con sentido no fueron notablemente diferentes de los cultivos no tratados con respecto a ningún criterio morfológico. Figura & # x200B Figura 7 7 A muestra una cultura tratada con sentido con procesos predominantemente similares a dendrita, mientras que Fig. & # x200B Fig.7 7 D muestra un cultivo tratado en antisentido con solo procesos similares a axones. Figura & # x200B Figura 7, 7, B y mi muestran que los procesos similares a dendrita de cultivos tratados con sentido son inmunorreactivos para CHO1 / MKLP1, mientras que los procesos en los cultivos tratados con antisentido no lo son. Los cultivos enjuagados libres de antisentido o no rellenados con antisentido cada 6 h mostraron la reaparición de inmunorreactividad de CHO1 / MKLP1, actividad mitótica y procesos dendríticos en 24 h (datos no mostrados).

Estudios de polaridad de microtúbulos

Dadas las propiedades de CHO1 / MKLP1 en el huso mitótico, es razonable especular que el papel principal del motor durante la formación del proceso es establecer el patrón de polaridad de microtúbulos no uniforme de los procesos similares a dendrita. Para investigar esto, se evaluó la orientación de la polaridad de los microtúbulos en los procesos de las células tratadas con AS1 tanto en ausencia como en presencia de ácido retinoico. Dado que el tratamiento antisentido prácticamente elimina la formación de procesos con morfología similar a la dendrita, se eligieron al azar procesos de ocho células diferentes para los análisis de polaridad de microtúbulos. Todos estos procesos tenían una morfología similar a un axón. En los ocho procesos de cultivos tratados con antisentido que no fueron tratados con ácido retinoico, el 99 & # x000b1 1% de los ganchos fueron en el sentido de las agujas del reloj (Fig. & # X200B (Fig. 7 7 F). En los ocho procesos de cultivos tratados con antisentido que también se trataron con ácido retinoico, el 97 & # x000b1 3% de los ganchos fueron en el sentido de las agujas del reloj. En cultivos tratados con S1, siete procesos similares a axones mostraron 96 & # x000b1 2% de ganchos en el sentido de las agujas del reloj, y siete procesos similares a dendrita mostraron 59 & # x000b1 13% de ganchos en el sentido de las agujas del reloj (Fig. & # X200B (Fig. C). Estos análisis indican que el tratamiento antisentido, pero no el tratamiento sentido, compromete el establecimiento de matrices de microtúbulos orientadas no uniformemente dentro de los procesos de desarrollo.


Samuel L. Volchenboum

Samuel Volchenboum es un médico que trata cánceres y trastornos sanguíneos pediátricos, con una especialización en el tratamiento de niños con neuroblastoma y otros tumores sólidos pediátricos. Su investigación explora el uso de la computación para definir enfermedades con mayor detalle. Sus descubrimientos en genética podrían conducir a terapias personalizadas y dirigidas con mejores resultados y menos efectos secundarios tanto en niños como en adultos.

Como investigador y médico, Volchenboum se desempeña como profesor asistente en el Departamento de Pediatría. Sus metodologías de investigación incluyen el uso de proteómica para estudiar tumores sólidos pediátricos y la construcción de herramientas para el análisis de datos de espectrometría de masas de alto rendimiento.

Su laboratorio tiene una serie de colaboraciones externas, incluido un esfuerzo internacional multiinstitucional para establecer una base de datos para datos de pacientes con neuroblastoma. También trabaja con el Hospital Infantil de Filadelfia para estudiar los efectos de la señalización de TrkA y TrkB en líneas celulares de neuroblastoma.

Volchenboum es el del BSD Center for Research Informatics. También es director asociado del Instituto de Medicina Traslacional, Director Asociado de Investigación en Informática y miembro de la facultad y miembro del cuerpo docente del Instituto de Computación.

Volchenboum ha estado en la facultad de UChicago desde 2007, y en 2009 fue nombrado Becario de la Fundación St. Baldrick's. Volchenboum recibió su doctorado en biología molecular y su doctorado en medicina de la Escuela de Medicina de Mayo. Completó su residencia en el Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati antes de ir a Boston para su beca de hematología / oncología pediátrica en el Instituto de Cáncer Dana-Farber y el Hospital Infantil de Boston. También completó una beca en informática y recibió su maestría en informática biomédica del Instituto de Tecnología de Massachusetts.

Implementación de un sistema de aprendizaje en salud para la enfermedad de células falciformes.
Miller R, Coyne E, Crowgey EL, Eckrich D, Myers JC, Villanueva R, Wadman J, Jacobs-Allen S, Gresh R, Volchenboum SL, Kolb EA. Implementación de un sistema de aprendizaje en salud para la enfermedad de células falciformes. JAMIA Open. 3 de octubre de 2020 (3): 349-359.
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Adaptación del tratamiento para niños con neuroblastoma sobre la base de la clasificación de grupos de riesgo: pasado, presente y futuro.
Liang WH, Federico SM, London WB, Naranjo A, Irwin MS, Volchenboum SL, Cohn SL. Adaptación del tratamiento para niños con neuroblastoma sobre la base de la clasificación de grupos de riesgo: pasado, presente y futuro. JCO Clin Cancer Inform. 4 de octubre de 2020: 895-905.
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Respuesta a K. Beiske et al.
Sokol E, Desai AV, Applebaum MA, Valteau-Couanet D, Park JR, Pearson ADJ, Schleiermacher G, Irwin MS, Hogarty M, Naranjo A, Volchenboum S, Cohn SL, London WB. Respuesta a K. Beiske et al. J Clin Oncol. 2020 01 de noviembre 38 (31): 3720-3721.
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Desarrollo de un modelo de datos y datos comunes para tumores de células germinales.
Ci B, Yang DM, Krailo M, Xia C, Yao B, Luo D, Zhou Q, Xiao G, Xu L, Skapek SX, Murray MM, Amatruda JF, Klosterkemper L, Shaikh F, Faure-Conter C, Fresneau B, Volchenboum SL, Stoneham S, Lopes LF, Nicholson J, Frazier AL, Xie Y.Desarrollo de un modelo de datos y datos comunes para tumores de células germinales. JCO Clin Cancer Inform. 4 de junio de 2020: 555-566.
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La edad, la categoría diagnóstica, el grado del tumor y el índice de mitosis-cariorrexis son pronósticos independientes en el neuroblastoma: un proyecto del INRG.
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Uso de big data en oncología pediátrica: aplicaciones actuales y direcciones futuras.
Mayor A, Cox SM, Volchenboum SL. Uso de big data en oncología pediátrica: aplicaciones actuales y direcciones futuras. Semin Oncol. 2020 02 47 (1): 56-64.
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Los genotipos farmacogenómicos definen la ascendencia genética en los pacientes y permiten la implementación genómica específica de la población.
Hernandez W, Danahey K, Pei X, Yeo KJ, Leung E, Volchenboum SL, Ratain MJ, Meltzer DO, Stranger BE, Perera MA, O & # 039Donnell PH. Los genotipos farmacogenómicos definen la ascendencia genética en los pacientes y permiten la implementación genómica específica de la población. Pharmacogenomics J. 2020 02 20 (1): 126-135.
PMID: 31506565

Obtención de conocimientos en informes de patología a través de un enfoque de procesamiento de lenguaje natural con clasificación, reconocimiento de entidades nombradas y heurísticas de relación-extracción.
Oliwa T, Maron SB, Chase LM, Lomnicki S, Catenacci DVT, Furner B, Volchenboum SL. Obtención de conocimientos en informes de patología a través de un enfoque de procesamiento de lenguaje natural con clasificación, reconocimiento de entidades nombradas y heurísticas de relación-extracción. JCO Clin Cancer Inform. 2019 08 3: 1-8.
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La red mundial de organizaciones de investigación académica: intercambio de datos para curar enfermedades y permitir el aprendizaje de los sistemas de salud.
Fukushima M, Austin C, Sato N, Maruyama T, Navarro E, Rocca M, Demotes J, Haendel M, Volchenboum SL, Cowperthwaite M, Silverstein JC, Webb C, Sim I, Chase M, Speakman J, Augustine E, Ford DE , Kush R. La red mundial de organizaciones de investigación académica: intercambio de datos para curar enfermedades y permitir el aprendizaje de los sistemas de salud. Aprenda Health Syst. 3 de enero de 2019 (1): e10073.
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Uso de tecnología portátil, móvil y de sensores en ensayos clínicos de cáncer.
Cox SM, Carril A, Volchenboum SL. Uso de tecnología portátil, móvil y de sensores en ensayos clínicos de cáncer. JCO Clin Cancer Inform. 2018 12 2: 1-11.
PMID: 30652590


Fisiopatología

Marcadores cromosómicos y moleculares

Durante las últimas dos décadas, se han identificado muchas anomalías cromosómicas y moleculares en pacientes con neuroblastoma. Estos marcadores biológicos se han evaluado para determinar su valor en la asignación de pronóstico y algunos de ellos se han incorporado a las estrategias utilizadas para la asignación de riesgos.

El más importante de estos marcadores biológicos es MYCN. MYCN es un oncogén que se sobreexpresa en aproximadamente una cuarta parte de los casos de neuroblastoma mediante la amplificación del brazo distal del cromosoma 2. Este gen se amplifica en aproximadamente el 25% de los casos de novo y es más común en pacientes con enfermedad en estadio avanzado. Pacientes cuyos tumores tienen MYCN la amplificación tiende a tener una progresión tumoral rápida y un mal pronóstico, incluso en el contexto de otros factores favorables, como la enfermedad en estadio bajo o la enfermedad 4S.

En contraste con MYCN, expresión de la H-ras oncogén se correlaciona con etapas más bajas de la enfermedad. Citogenéticamente, la presencia de cuerpos de cromatina de doble minuto y regiones de tinción homogénea se correlaciona con MYCN amplificación de genes. La deleción del brazo corto del cromosoma 1 es la anomalía cromosómica más común presente en el neuroblastoma y confiere un mal pronóstico. La región del cromosoma 1p probablemente alberga genes supresores de tumores o genes que controlan la diferenciación de neuroblastos. La deleción de 1p es más común en tumores casi diploides y se asocia con una etapa más avanzada de la enfermedad. La mayoría de las deleciones de 1p se encuentran en el área 1p36 del cromosoma.

Una relación entre 1p pérdida de heterocigosidad (LOH) y MYCN Se ha descrito la amplificación. Se han informado otras pérdidas alélicas de los cromosomas 11q, 14q y 17q, lo que sugiere que otros genes supresores de tumores pueden estar localizados en estos cromosomas. Se ha descrito la pérdida de heterocigosidad en 11q23 y es un factor pronóstico independiente. Otra característica del neuroblastoma es la ganancia frecuente del cromosoma 1.

El índice de ADN es otra prueba útil que se correlaciona con la respuesta a la terapia en los bebés. Mira et al. demostraron que los bebés cuyo neuroblastoma tiene hiperdiploidía (es decir, índice de ADN & gt1) tienen una buena respuesta terapéutica a la ciclofosfamida y la doxorrubicina. [1] En contraste, los bebés cuyos tumores tienen un índice de ADN de 1 responden menos a la última combinación y requieren una terapia más agresiva. El índice de ADN no tiene ningún significado pronóstico en niños mayores. De hecho, la hiperdiploidía en los niños ocurre con mayor frecuencia en el contexto de otras anomalías cromosómicas y moleculares que confieren un mal pronóstico.

Tres productos génicos del receptor de neurotrofina, TrkA, TrkB y TrkC, son tirosina quinasas que codifican un receptor de miembros de la familia del factor de crecimiento nervioso (NGF). Sus ligandos incluyen el receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) NGF y factores neurotróficos derivados del cerebro (BDNF). Curiosamente, la expresión de TrkA se correlaciona inversamente con la amplificación de la MYCN gen, y la expresión del TrkC el gen está correlacionado con la expresión de TrkA. En la mayoría de los pacientes menores de 1 año, una alta expresión de TrkA se correlaciona con un buen pronóstico, especialmente en pacientes con estadios 1, 2 y 4S. Por el contrario, TrkB se expresa más comúnmente en tumores con MYCN amplificación. Esta asociación puede representar una vía de supervivencia autocrina.

La alteración de las vías apoptóticas normales también puede desempeñar un papel en la patología del neuroblastoma. La interrupción de estas vías normales puede desempeñar un papel en la respuesta a la terapia como resultado del silenciamiento epigenético de los promotores de genes en las vías apoptóticas. Los fármacos que se dirigen a la metilación del ADN, como la decitabina, se están explorando en estudios preliminares.

Otros marcadores biológicos asociados con un mal pronóstico incluyen niveles elevados de ARN de telomerasa y falta de expresión de la glicoproteína CD44 en la superficie de la célula tumoral. La glicoproteína P (P-gp) y la proteína de resistencia a múltiples fármacos (MRP) son 2 proteínas expresadas en el neuroblastoma. Estas proteínas confieren un fenotipo multirresistente (MDR) en algunos cánceres. Su papel en el neuroblastoma es controvertido. La reversión de la MDR es un objetivo para el desarrollo de nuevos fármacos.

Un estudio de Challagundla et al informó que los microARN exosómicos liberados en el entorno del neuroblastoma afectan la resistencia a la quimioterapia. [2]

Anatómico

El origen y el patrón de migración de los neuroblastos durante el desarrollo fetal explica los múltiples sitios anatómicos donde ocurren estos tumores, la ubicación de los tumores varía con la edad. Los tumores pueden desarrollarse en la cavidad abdominal (40% ganglios suprarrenales, 25% paraespinales) u otros sitios (15% tumores torácicos, 5% pélvicos, 3% cervicales, 12% varios). Los bebés se presentan con mayor frecuencia con tumores torácicos y cervicales, mientras que los niños mayores tienen tumores abdominales con mayor frecuencia.

La mayoría de los pacientes presentan signos y síntomas relacionados con el crecimiento tumoral, aunque se han detectado pequeños tumores debido al uso común de la ecografía prenatal. Los tumores abdominales grandes a menudo provocan un aumento de la circunferencia abdominal y otros síntomas locales (p. Ej., Dolor). Los tumores paraespinales con mancuernas pueden extenderse al canal espinal, incidir en la médula espinal y causar disfunción neurológica.

El estadio del tumor en el momento del diagnóstico y la edad del paciente son los factores pronósticos más importantes. Aunque los pacientes con tumores localizados (independientemente de la edad) tienen un resultado excelente (tasa de supervivencia sin complicaciones [SSC] a 3 años del 80-90%), los pacientes mayores de 18 meses con enfermedad metastásica evolucionan mal. Generalmente, más del 50% de los pacientes presentan enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico, 20-25% tienen enfermedad localizada, 15% tienen extensión regional y aproximadamente 7% se presentan durante la infancia con enfermedad diseminada limitada a la piel, el hígado y médula ósea (estadio 4S).

Fisiológico y bioquímico

Más del 90% de los pacientes tienen niveles elevados de ácido homovanílico (HVA) y / o ácido vanililmandélico (VMA) detectables en la orina. Los estudios de detección masiva que utilizan catecolaminas urinarias en recién nacidos y lactantes en Japón, Quebec y Europa han demostrado la capacidad de detectar el neuroblastoma antes de que sea clínicamente evidente. Sin embargo, la mayoría de los tumores identificados ocurren en lactantes con buen pronóstico. Ninguno de estos estudios muestra que los exámenes de detección masivos reduzcan las muertes por neuroblastoma de alto riesgo.

Los marcadores asociados con un mal pronóstico incluyen (1) niveles elevados de ferritina, (2) niveles elevados de lactato deshidrogenasa (LDH) sérica y (3) niveles elevados de enolasa sérica específica de neuronas (NSE). Sin embargo, estos marcadores se han vuelto menos importantes debido al descubrimiento de biomarcadores más relevantes (es decir, marcadores cromosómicos y moleculares). De hecho, la ferritina no se incluyó en la formulación reciente del Sistema Internacional de Clasificación de Grupos de Riesgo de Neuroblastoma porque no se encontró que presentara una diferencia pronóstica en el grupo de alto riesgo.

Histológico

Las células madre simpáticas pluripotentes migran y se diferencian para formar los diferentes órganos del sistema nervioso simpático. La glándula suprarrenal normal consta de células cromafines, que producen y secretan catecolaminas y neuropéptidos. Otras células incluyen células sustentaculares, que son similares a las células de Schwann, y células ganglionares dispersas. Histológicamente, los tumores de la cresta neural se pueden clasificar como neuroblastoma, ganglioneuroblastoma y ganglioneuroma, según el grado de maduración y diferenciación del tumor.

Los neuroblastomas indiferenciados se presentan histológicamente como tumores pequeños, redondos, de células azules con densos nidos de células en una matriz fibrovascular y pseudorosetas de Homer-Wright. Estas pseudorosetas, que se observan en el 15-50% de las muestras tumorales, pueden describirse como neuroblastos que rodean procesos neuríticos eosinofílicos. El tumor típico muestra pequeñas células uniformes con escaso citoplasma y núcleos hipercromáticos. Un proceso neurítico, también llamado neuropilo, es una característica patognomónica de las células del neuroblastoma. Las tinciones inmunohistoquímicas de NSE, cromogranina, sinaptofisina y S-100 suelen ser positivas. La microscopía electrónica puede ser útil porque las características ultraestructurales (p. Ej., Neurofilamentos, neurotúbulos, vasos sinápticos, gránulos de núcleo denso) son diagnósticos de neuroblastoma.

Por el contrario, el ganglioneuroma completamente benigno se compone típicamente de células ganglionares maduras, células de Schwann y procesos neuríticos, mientras que los ganglioneuroblastomas incluyen todo el espectro de diferenciación entre ganglioneuromas puros y neuroblastomas.Debido a la presencia de diferentes componentes histológicos, el patólogo debe evaluar minuciosamente el tumor; las regiones con diferente apariencia macroscópica pueden demostrar una histología diferente.

Los nódulos neuroblásticos están presentes en la glándula suprarrenal fetal y alcanzan su punto máximo entre las 17 y 18 semanas de gestación. La mayoría de estos nódulos retroceden espontáneamente y probablemente representan restos del desarrollo fetal. Algunos de estos pueden persistir y conducir al desarrollo de neuroblastoma.

Sistema de clasificación histopatológica de Shimada

Shimada et al desarrollaron una clasificación histopatológica en pacientes con neuroblastoma. [3] Este sistema de clasificación se evaluó retrospectivamente y se correlacionó con el resultado en 295 pacientes con neuroblastoma que fueron tratados por el Children's Cancer Group (CCG). Las características importantes de la clasificación incluyen (1) el grado de diferenciación de neuroblastos, (2) la presencia o ausencia de desarrollo del estroma de Schwann (rico en estroma, pobre en estroma), (3) el índice de proliferación celular (conocido como mitosis-cariorrexis índice [MKI]), (4) patrón nodular y (5) edad. Con estos componentes, los pacientes se pueden clasificar en los siguientes grupos de histología:

El grupo de histología favorable incluye lo siguiente:

Pacientes de cualquier edad con tumores ricos en estroma sin patrón nodular

Pacientes menores de 18 meses con tumores pobres en estroma, un MKI de menos de 200/5000 (200 células cariorrecticas por 5000 células escaneadas) y neuroblastos diferenciados o indiferenciados

Pacientes menores de 60 meses con tumores pobres en estroma, un MKI de menos de 100/5000 y células tumorales bien diferenciadas

El grupo de histología desfavorable incluye lo siguiente:

Pacientes de cualquier edad con tumores ricos en estroma y patrón nodular

Pacientes de cualquier edad con tumores pobres en estroma, neuroblastos indiferenciados o diferenciados y un MKI superior a 200/5000

Pacientes mayores de 18 meses con tumores pobres en estroma, neuroblastos indiferenciados y un MKI superior a 100/5000

Pacientes mayores de 18 meses con tumores pobres en estroma, neuroblastos diferenciados y un MKI de 100-200 / 5000

Pacientes mayores de 60 meses con neuroblastos diferenciados con estrato pobre y un MKI menor de 100

La clasificación original de Shimada et al fue adoptada e integrada en la Clasificación Internacional de Patología del Neuroblastoma (INPC). Esto fue revisado más recientemente. [4] El sistema INPC sigue dependiendo de la edad.


Resumen 4130: Los niveles de expresión de TRIM37 dictan la susceptibilidad a la eliminación del centrosoma, lo que respalda la inhibición de Plk4 como una nueva estrategia potencial para atacar el neuroblastoma

Los centrosomas son los principales centros de organización de microtúbulos en las células animales. Los centrosomas catalizan el ensamblaje de microtúbulos para acelerar la formación del huso mitótico bipolar que segrega los cromosomas durante la división celular. Para analizar el efecto de la eliminación del centrosoma en células normales y cancerosas, desarrollamos centrinona, un inhibidor potente, específico y celularmente activo de la proteína quinasa quinasa tipo polo 4 (Plk4), que es esencial para la duplicación del centrosoma (Wong et al. , 2015, Science 348: 1155-60). Las células sin centrosoma tardan más en ejecutar la mitosis y desencadenan una vía de señalización de estrés mitótico que da como resultado la estabilización de p53 y la apoptosis y / o senescencia de las células hijas resultantes. La falta de formación de un huso también puede conducir a la apoptosis durante la mitosis o la salida de la mitosis sin segregación cromosómica (deslizamiento mitótico). En una pantalla de pérdida de función CRISPR / Cas9 de todo el genoma para la resistencia a la centrinona, previamente habíamos demostrado que la pérdida de la ubiquitina ligasa TRIM37 hace que el ensamblaje del huso sea más robusto para la eliminación del centrosoma (Meitinger et al., 2016, J Cell Biol. 214: 155-66), lo que aumenta la posibilidad de que niveles altos de TRIM37 puedan aumentar la sensibilidad a la eliminación del centrosoma. Aquí, describimos el uso de ensayos de imágenes en vivo de una sola célula para identificar los determinantes de la vulnerabilidad de las células cancerosas a la eliminación del centrosoma. Entre un panel de 37 líneas celulares probadas, las líneas celulares derivadas del neuroblastoma fueron las más sensibles a la eliminación del centrosoma, exhibiendo altos niveles de apoptosis y una rápida pérdida de viabilidad después del tratamiento con centrinona. Encontramos que la sensibilidad a la eliminación del centrosoma se correlacionó con los niveles de expresión de TRIM37. Tras el agotamiento del centrosoma, las células con niveles elevados de TRIM37, en particular las células del neuroblastoma, mostraron una duración mitótica y una frecuencia de insuficiencia mitótica muy aumentadas. Las líneas celulares de neuroblastoma positivas para p53 exhibieron apoptosis como resultado de la activación de p53 mediada por estrés mitótico y de insuficiencia mitótica. Sorprendentemente, las líneas celulares de neuroblastoma negativo para p53, que son incapaces de detectar el estrés mitótico, también fueron muy sensibles a la eliminación del centrosoma, y ​​la muerte celular en este caso se debe a altas tasas de insuficiencia mitótica. La deleción de TRIM37 restauró la capacidad de las células para proliferar en centrinona. Por tanto, la eliminación del centrosoma mediante la inhibición de Plk4 parece ser una estrategia prometedora para el tratamiento terapéutico de neuroblastomas y potencialmente otros cánceres con altos niveles de expresión de TRIM37.

Formato de cita: Franz Meitinger, Robert L. Davis, Ruth Kabeche, John V. Anzola, Yao Liang Wong, Andrew K. Shiau, Arshad Desai, Karen Oegema. Los niveles de expresión de TRIM37 dictan la susceptibilidad a la eliminación del centrosoma, lo que respalda la inhibición de Plk4 como una nueva estrategia potencial para atacar el neuroblastoma [resumen]. En: Actas de la reunión anual de la Asociación Estadounidense para la Investigación del Cáncer 2018 2018 14-18 de abril Chicago, IL. Filadelfia (PA): AACR Cancer Res 201878 (13 Suppl): Resumen n ° 4130.


Tratamiento del neuroblastoma en estadio 4S del INSS y en estadio MS de INRG

Los pacientes en estadio 4S del International Neuroblastoma Staging System (INSS) son menores de 12 meses y tienen un tumor primario en estadio 1 o 2 del INSS, mientras que los pacientes con EM en estadio del International Neuroblastoma Risk Group (INRG) son menores de 18 meses con cualquier estadio del tumor primario. Ambos sistemas de estadificación tienen la misma definición de patrón limitado de metástasis.

La decisión del Grupo de Trabajo del INRG de reemplazar la categoría de enfermedad 4S por la de la nueva definición de EM se basó en informes en los que un pequeño número de lactantes con tumores primarios L2 y patrones metastásicos 4S, incluidos pacientes de 12 a 18 meses, tuvieron resultados favorables. [1,2] Un estudio posterior de los datos reales del INRG encontró que una serie de características biológicas predijeron un resultado precario de los pacientes de 12 a 18 meses con enfermedad en estadio de EM, y que solo los bebés con favorable la biología tuvo resultados a largo plazo similares a los del diagnóstico tradicional de las 4S. [2]

Muchos pacientes con neuroblastoma en estadio 4S / MS no requieren tratamiento. Sin embargo, los tumores con una biología desfavorable o los pacientes sintomáticos debido a la evolución de la hepatomegalia y el compromiso de los órganos tienen un mayor riesgo de muerte y se tratan con quimioterapia de dosis baja a dosis moderada. Ocho por ciento a 10% de estos pacientes tendrán MYCN amplificación y se tratan con protocolos de alto riesgo. [3]

Los criterios de asignación al grupo de neuroblastoma 4S del Children's Oncology Group (COG) utilizados anteriormente se describen en la Tabla 15.

Tabla 15. Esquema de asignación de grupo de neuroblastoma en estadio 4S del Grupo de Oncología Infantil # 8217s (COG) utilizado para los estudios COG-P9641, COG-A3961 y COG-A3973 a
INSS Stage & # 160Edad & # 160MYCN Estado & # 160Clasificación INPC & # 160ADN ploidía b & # 160OtroGrupo de riesgo & # 160
DI = índice de ADN INPC = Clasificación patológica internacional del neuroblastoma INSS = Sistema internacional de estadificación del neuroblastoma.
a Los ensayos COG-P9641 (NCT00003119), COG-A3961 (NCT00003093) y COG-A3973 (NCT00004188) establecieron el estándar actual de atención para pacientes con neuroblastoma en términos de asignación de grupos de riesgo y estrategias de tratamiento.
b Ploidía del ADN: DI & gt1 es favorable, DI = 1 es desfavorable. Un tumor hipodiploide (con DI & lt1) se tratará como un tumor con un DI & gt1 (DI & lt1 [hipodiploide] para ser considerado ploidía favorable).
c Los lactantes en estadio 4S del INSS con biología y síntomas clínicos favorables se tratan con quimioterapia inmediata hasta que estén asintomáticos o de acuerdo con las pautas del protocolo. Los síntomas clínicos incluyen los siguientes: dificultad respiratoria con o sin hepatomegalia o compresión de la médula y déficit neurológico o compresión de la vena cava inferior e isquemia renal u obstrucción genitourinaria u obstrucción gastrointestinal y vómitos o coagulopatía con hemorragia clínica significativa que no responde a la terapia de reemplazo.
4S c & # 160& lt365 d & # 160No amplificado & # 160Favorable & # 160DI & gt1 & # 160AsintomáticoBajo & # 160
& lt365 d & # 160No amplificado & # 160Cualquiera & # 160DI = 1 y # 160Asintomático o sintomáticoIntermedio & # 160
& lt365 d & # 160No amplificado & # 160Desfavorable & # 160Cualquiera & # 160Asintomático o sintomáticoIntermedio & # 160
& lt365 d & # 160DesaparecidoDesaparecidoDesaparecidoDemasiado enfermo para una biopsiaIntermedio & # 160
& lt365 d & # 160No amplificado & # 160Cualquiera & # 160Cualquiera & # 160Sintomático Intermedio & # 160
& lt365 d & # 160Amplificado & # 160Cualquiera & # 160Cualquiera & # 160Asintomático o sintomáticoAlto & # 160

La Tabla 16 muestra la clasificación INRG para el neuroblastoma en estadio MS utilizada en los estudios del COG en curso.

Tabla 16. Esquema de clasificación previa al tratamiento del International Neuroblastoma Risk Group (INRG) para el neuroblastoma en estadio MS a
Etapa INRGCategoría histológicaGrado de diferenciación tumoralMYCNAberración 11qPloidíaGrupo de riesgo previo al tratamiento
NA = no amplificado.
a Reproducido con permiso. & # 169 (2015) Sociedad Estadounidense de Oncología Clínica. Reservados todos los derechos. Pinto N et al .: Advances in Risk Classification and Treatment Strategies for Neuroblastoma, J Clin Oncol 33 (27), 2015: 3008 & # 82113017. [4]
SRA 
 Edad & lt18 meses  N / ANo  C (muy bajo)
 Q (alto)
Amplificado  R (alto)

Opciones de tratamiento para el neuroblastoma en estadio 4S / MS

No existe un enfoque estándar para el tratamiento del neuroblastoma en estadio 4S / MS.

Las opciones de tratamiento para el neuroblastoma en estadio 4S / MS son las siguientes:

    (para pacientes asintomáticos con biología tumoral favorable). (para pacientes sintomáticos, lactantes muy pequeños o pacientes con biología desfavorable). (raramente para pacientes con síntomas relacionados con hepatomegalia por enfermedad metastásica).

La resección del tumor primario no se relaciona con un mejor resultado. [5-7] En raras ocasiones, los bebés con neuroblastoma hepático 4S / MS masivo desarrollan cirrosis debido a la quimioterapia o la radioterapia que se usa para controlar la enfermedad y pueden beneficiarse del trasplante de hígado ortotópico . [8]

Observación con cuidados de apoyo

La observación con cuidados de apoyo se utiliza para tratar a pacientes asintomáticos con una biología tumoral favorable.

El tratamiento de los niños con enfermedad en estadio 4S / EM depende de la presentación clínica. [5,6] La mayoría de los pacientes no requieren tratamiento a menos que la enfermedad voluminosa esté causando compromiso de los órganos y riesgo de muerte.

Quimioterapia

La quimioterapia se usa para tratar pacientes sintomáticos, bebés muy pequeños (diagnosticados antes de los 2 meses de edad) o pacientes con biología desfavorable. Los pacientes con evidencia de crecimiento tumoral rápido en las primeras semanas de vida requieren una intervención inmediata con quimioterapia para evitar el síndrome compartimental abdominal potencialmente irreversible y la insuficiencia hepática o renal. [9]

Los lactantes diagnosticados con neuroblastoma en estadio 4S / MS del INSS, en particular los que tienen hepatomegalia o los menores de 3 meses, tienen el potencial de un rápido deterioro clínico y pueden beneficiarse del inicio temprano de la terapia. [9] Ha sido difícil identificar a los bebés con enfermedad en etapa 4S que se beneficiarán de la quimioterapia.

Se desarrolló un sistema de puntuación para medir los signos y síntomas de deterioro o compromiso para evaluar mejor a este grupo de pacientes en estadio 4S. [10] Este sistema de puntuación se evaluó retrospectivamente, fue predictivo del curso clínico y se aplicó de forma prospectiva para guiar el tratamiento de los pacientes con enfermedad en estadio 4S del INSS. [10,11] El sistema de puntuación se modificó sobre la base del ANBL0531 ( NCT00499616) da como resultado los bebés más pequeños discutidos anteriormente para guiar la intervención quimioterapéutica para 4S / MS en bebés. [9]

Se han utilizado varios regímenes de quimioterapia (ciclofosfamida sola, carboplatino / etopósido, ciclofosfamida / doxorrubicina / vincristina) para tratar pacientes sintomáticos. El enfoque es administrar la quimioterapia solo mientras persistan los síntomas para evitar la toxicidad, que contribuye a una peor supervivencia. Además, a menudo se recomiendan dosis más bajas de quimioterapia para bebés muy pequeños o de bajo peso, junto con factores estimulantes de colonias de granulocitos después de cada ciclo de quimioterapia.

Datos probatorios (quimioterapia para la enfermedad 4S / MS):

  1. El ensayo COG ANBL0531 (NCT00499616) estudió prospectivamente un subconjunto de pacientes 4S que habían MYCN-tumores no amplificados con disfunción orgánica deteriorada o inminente o biología desfavorable (histología desfavorable y / o índice de ADN diploide). Se inscribieron 49 pacientes, 41 de los cuales eran sintomáticos y 28 tenían una biología desfavorable. Se asignó a los pacientes para recibir dos, cuatro u ocho ciclos de quimioterapia según la biología del tumor, la edad del paciente y los síntomas. [9] [Grado de comprobación: 3iiiA]
  • La supervivencia global (SG) a 3 años fue del 81,4%. Ocho de las nueve muertes ocurrieron en pacientes menores de 2 meses en el momento del diagnóstico. Cinco muertes se relacionaron con complicaciones agudas de la hepatomegalia de rápida progresión (es decir, síndrome del compartimento abdominal, insuficiencia renal, insuficiencia respiratoria, coagulopatía e infección). Los pacientes menores de 40 días en el momento del diagnóstico tenían más de 13 veces el riesgo de morir en comparación con los pacientes mayores de 47 días. El estudio se modificó después de las cinco muertes para exigir quimioterapia inmediata para pacientes con enfermedad 4S menores de 2 meses en el momento del diagnóstico con hepatomegalia en evolución. No se produjeron muertes relacionadas con las complicaciones de la hepatomegalia en los lactantes subsiguientes incluidos, incluidos 18 lactantes menores de 2 meses.

La descompresión abdominal quirúrgica de urgencia se puede utilizar para evitar el deterioro respiratorio y mejorar la ventilación. [12,13]

  • En general, la supervivencia sin complicaciones (SSC) a 5 años fue del 77% y la SG fue del 91%.
  • La SSC a 5 años fue del 63% y la SG fue del 84% para los 41 pacientes con neuroblastoma en estadio 4S asintomático tratados con cirugía o biopsia sola, la SSC fue del 95% y la SG fue del 97% para los 39 pacientes tratados con cirugía y quimioterapia (SSC PAG = .0016 SO PAG = .1302).

Anteriormente, se pensaba que la toxicidad de la quimioterapia era responsable de la menor supervivencia de los pacientes con enfermedad en estadio 4S; sin embargo, el uso de quimioterapia en el ensayo COG-P9641 se restringió a situaciones clínicas específicas con un número recomendado de ciclos.

  • Los bebés que se volvieron sintomáticos tuvieron insuficiencia orgánica relacionada con la enfermedad y complicaciones infecciosas que dieron como resultado una SG inferior en comparación con los que recibieron quimioterapia inmediata (cuatro a ocho ciclos de terapia). La SG a 3 años de los lactantes que no recibieron quimioterapia fue del 84% frente al 97% de los lactantes que recibieron quimioterapia (PAG = .1321).

La quimioterapia para pacientes con altas puntuaciones de síntomas incluyó de dos a cuatro ciclos de 3 días de carboplatino y etopósido si los síntomas persistieron o se desarrolló una enfermedad progresiva, se administraron hasta cuatro ciclos de 5 días de ciclofosfamida, doxorrubicina y vincristina. La mitad de los pacientes fueron sometidos a resección completa o parcial del tumor primario.

  • No hubo diferencia en la SSC a 2 años y la SG entre pacientes asintomáticos y sintomáticos (SSC, 87% vs 88% SG, 98% vs 97%), aunque muchos de los investigadores prefirieron administrar quimioterapia en presencia de un puntuación de síntomas baja.
  • Para los lactantes con puntuaciones bajas de síntomas, no hubo diferencia en el resultado entre los lactantes no tratados inicialmente (n = 56 SG, 93%) y los lactantes tratados (n = 30 SG, 86%).
  • La SG fue del 90% para los lactantes que presentaban puntuaciones altas de síntomas.
  • No hubo diferencias significativas en la SG a 2 años entre pacientes con tumores primarios irresecables y pacientes con tumores primarios resecables (97% frente a 100%) y entre pacientes con gammagrafía esquelética negativa y positiva sin anomalías radiológicas (100% frente a 97%) .

Radioterapia (para pacientes con síntomas relacionados con hepatomegalia por enfermedad metastásica)

En casos raros de hepatomegalia marcada en lactantes con esclerosis múltiple sintomática (4S) con neuroblastoma que no respondieron a la quimioterapia, se ha utilizado radioterapia de dosis muy baja. En una serie de 41 bebés sintomáticos con enfermedad de EM, se administró radioterapia a cinco bebés, tres de los cuales murieron. [9]

Opciones de tratamiento en evaluación clínica

Se puede encontrar información sobre el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) y los ensayos clínicos respaldados # 8211 en el sitio web del NCI. Para obtener información sobre los ensayos clínicos patrocinados por otras organizaciones, consulte el sitio web ClinicalTrials.gov.

El siguiente es un ejemplo de un ensayo clínico nacional y / o institucional que se está llevando a cabo actualmente:

  • ANBL1232 (NCT02176967) (Factor de riesgo basado en respuesta y biología & # 8211 Terapia guiada para el tratamiento de pacientes más jóvenes con neuroblastoma de alto riesgo y no & # 8211):
  • Los pacientes menores de 3 meses con hepatomegalia existente o en evolución o que presentan síntomas ingresan al ensayo y la quimioterapia comienza de inmediato. La estadificación completa debe completarse dentro de 1 mes; no se realiza una biopsia del tumor hasta que el paciente esté estable.
  • Los pacientes de 3 a 12 meses que presentan síntomas ingresan al ensayo y la quimioterapia comienza de inmediato. La biopsia del tumor se realiza una vez que el paciente está estable.
  • Los pacientes de 12 a 18 meses que presentan síntomas se someten a una biopsia del tumor antes de comenzar la quimioterapia.
  • Los pacientes de 3 a 18 meses que están asintomáticos y los pacientes menores de 3 meses que están asintomáticos y no tienen hepatomegalia evolutiva se someten a una biopsia del tumor seguida de una observación cercana inicialmente, que continuará durante 3 años.

Los pacientes con tumores INRG MS que tienen una histología desfavorable o características genómicas desfavorables con o sin síntomas se tratan de acuerdo con un algoritmo basado en la respuesta para determinar la duración del tratamiento. Para los pacientes con EM con INRG bajo observación sin quimioterapia, se utiliza un sistema de puntuación objetivo para monitorearlos en busca de cambios clínicos e iniciar la terapia. Para los pacientes con resolución completa de los síntomas y al menos una reducción del 50% en el volumen del tumor primario (respuesta parcial), se suspende la quimioterapia y la observación continúa durante 3 años después de completar la terapia. Si la enfermedad progresa, el paciente abandona este estudio.

Ensayos clínicos actuales

Utilice nuestra búsqueda avanzada de ensayos clínicos para encontrar ensayos clínicos sobre el cáncer respaldados por el NCI que ahora están inscribiendo pacientes. La búsqueda se puede restringir según la ubicación del ensayo, el tipo de tratamiento, el nombre del fármaco y otros criterios. También se encuentra disponible información general sobre ensayos clínicos.

Referencias
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  13. Harper L, Perel Y, Lavrand F, et al .: Manejo quirúrgico de la hepatomegalia relacionada con el neuroblastoma: ¿realmente cuentan el material y el método? Pediatr Hematol Oncol 25 (4): 313-7, 2008. & # 160 [PUBMED Abstract]
  14. Strother DR, London WB, Schmidt ML, et al .: Resultado después de la cirugía sola o con uso restringido de quimioterapia para pacientes con neuroblastoma de bajo riesgo: resultados del estudio P9641 del Children's Oncology Group. J Clin Oncol 30 (15): 1842-8, 2012. & # 160 [Resumen de PUBMED]

Los biólogos descubren un nuevo mecanismo de división celular

Hasta ahora, se creía que los cromosomas solo jugaban un papel pasivo en la división de células animales. Crédito de la imagen: NIH.

La división celular es fundamental para todas las formas de vida. El cuerpo humano se desarrolla a partir de una sola célula que se divide miles de millones de veces para generar todos los tipos de tejidos, y algunas de estas células continúan dividiéndose miles de millones de veces al día durante toda la vida.

Sin embargo, por el momento, los mecanismos moleculares involucrados no se comprenden completamente, y hasta ahora se desconocía si los cromosomas podrían desempeñar un papel activo en la división celular.

En las células animales, la división implica mitosis, la separación de los cromosomas seguida de la división de la célula en dos nuevas células hijas por citocinesis.

"La división es un proceso complejo y robusto que generalmente se realiza sin problemas, pero cuando ocurre un error en la separación del ADN o durante la citocinesis, puede ser una fuente para desencadenar cáncer, por ejemplo", dijo el coautor del estudio, el Dr. Gilles Hickson de la Universidad. de Montreal, Canadá.

Trabajando con células de la mosca de la fruta, el Dr. Hickson y sus coautores descubrieron que los cromosomas emiten señales que influyen en la corteza de la célula para reforzar la acción de los microtúbulos.

Una de las señales clave involucradas que identificaron actúa a través de un complejo enzimático, una fosfatasa conocida como Sds22-PP1, que se encuentra en los cinetocoros.

Los científicos también demostraron que esta vía de señalización actúa en las células humanas.

“Esta conservación evolutiva de las moscas a los humanos se espera para procesos tan fundamentales como la división celular. Esto es lo que hace que las moscas de la fruta sean un sistema tan poderoso para ayudarnos a comprender la biología humana ”, dijo el Dr. Hickson.

“Cuando los cromosomas se segregan, se acercan a la membrana en los polos de la célula, y gracias a las acciones de esta enzima, esto contribuye al ablandamiento de la membrana polar, facilitando el alargamiento de la célula y la consiguiente división que se produce en el ecuador."

El descubrimiento de este mecanismo es un avance significativo en el avance del conocimiento sobre el proceso de división celular.

“Hemos estado observando cómo las células se dividen durante más de 100 años, pero seguimos buscando comprender los mecanismos moleculares involucrados. Esto es importante porque la división celular es fundamental para la vida y para ciertas enfermedades ”, dijo el Dr. Hickson.

De hecho, todos los cánceres se caracterizan por una división celular descontrolada y los procesos subyacentes son objetivos potenciales para intervenciones terapéuticas que previenen la aparición y propagación del cáncer.

“Pero antes de llegar allí, debemos continuar ampliando nuestro conocimiento sobre los procesos básicos y las señales involucradas en la división celular normal para comprender cómo pueden salir mal o cómo se pueden explotar. Además, los diferentes tipos de células en el cuerpo, e incluso en el mismo tejido, no siempre se dividen exactamente de la misma manera ".

“Por ejemplo, las células madre se dividen asimétricamente, mientras que la mayoría de las demás células se dividen simétricamente, y todavía no comprendemos estas diferencias en términos moleculares. Con la ayuda de modelos genéticos robustos y bien caracterizados, como la mosca de la fruta, lo lograremos ”.

"En última instancia, esto podría ayudar al diseño racional de terapias más específicas para inhibir la división de las células cancerosas, idealmente sin afectar las células sanas que se están dividiendo al mismo tiempo", concluyó el Dr. Hickson.


Ver el vídeo: División celular (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Neville

    Lo que te puso en mente

  2. Abdul- Sami

    Competente :) Mensaje, es entretenido ...

  3. Verrell

    algo no sale asi

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  5. Sheron

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  6. Miles

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  7. Meztinos

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