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¿Cuál es la razón para tener un sitio de reconocimiento adicional para una enzima de restricción?

¿Cuál es la razón para tener un sitio de reconocimiento adicional para una enzima de restricción?


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¿Se puede determinar el tamaño de un ADN plasmídico superenrollado utilizando un fragmento de tamaño de ADN estándar sometido a electroforesis en paralelo? 2. Se escindió una molécula de ADN desconocida usando varias enzimas de restricción individualmente y en varias combinaciones. Los tamaños de los fragmentos de ADN se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se cartografiaron los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Posteriormente, se secuenció el ADN y se encontró un sitio de reconocimiento adicional para una de las enzimas. Sin embargo, todos los demás datos de mapeo fueron consistentes, dentro de los errores experimentales, con los datos de secuencia. ¿Cuáles son las explicaciones más simples para esta discrepancia? Suponga que la secuencia de ADN no tiene errores.

Mi respuesta:

el sitio de reconocimiento de la enzima adicional se cortó con el fragmento debido a la digestión parcial que se produjo debido a que se agregó una cantidad insuficiente de enzima o la rxn se detuvo después de un tiempo muy corto.

¿Me equivoco? mi lógica aquí fue tal que solo encontraron el sitio de reconocimiento adicional después de secuenciar el ADN, por lo que no estaba disponible durante el rxn y, por lo tanto, se cortó de manera desigual en uno de los fragmentos O podría haber tenido la secuencia complementaria que estaba metilado que lo ocultaba.

¡Se agradecen las respuestas detalladas!


El escenario en su pregunta se puede explicar si el sitio de reconocimiento "extra" se mapeó muy cerca de otro sitio de reconocimiento para la misma enzima.

Por ejemplo, si hubiera 2 EcoRI sitios separados por entre 0-50 pb de ADN plasmídico, luego, dependiendo del tipo de gel que se utilice, el diminuto fragmento de ADN resultante generado podría ser difícil de detectar (ya sea porque pequeños fragmentos se escurren por la parte inferior del gel o porque no no se resuelve bien a menos que el gel contenga un porcentaje más alto de agarosa o acrilamida).

De manera similar, según el tamaño de los fragmentos adyacentes en los diversos digestiones y las limitaciones de este ensayo para estimar el tamaño de los fragmentos, es posible que no detecte que se generó un fragmento "extra" y que "falta".


Capítulo 20 - Tecnología de ADN recombinante

una enzima producida principalmente por ciertas bacterias, que tiene la propiedad de escindir moléculas de ADN en o cerca de una secuencia específica de bases / secuencias de reconocimiento.

se une a secuencia de reconocimiento o sitio de restricción

luego corta ambas hebras de ADN dentro de ese
secuencia al escindir la columna vertebral del fosfodiéster del ADN

(comúnmente conocido como & quot digestión de ADN & quot)

producido en bacterias como defensa contra la infección por bacteriófagos. Restringir / prevenir la infección viral por degradación del ADN.

la utilidad en la clonación se deriva de la capacidad innata de cortar de forma precisa y reproducible el ADN genómico en fragmentos

presente al azar en el genoma.

El número de fragmentos de restricción de ADN producidos al digerir el ADN con una enzima en particular se puede estimar a partir del número de veces que una enzima de restricción determinada corta el ADN (4 ^ n, n = número de secuencias de reconocimiento de bases)

permanecer juntos por enlaces de hidrógeno entre pares de bases

capaz de replicarse en las células huésped: permite la replicación independiente del vector de adn y de cualquier fragmento de adn que lleve

distinguir las células huésped que han captado vectores de aquellas que no tienen --- un gen marcador seleccionable

Propiedades clave:
Puede replicar fragmentos de ADN clonados en la célula huésped

Tener varios sitios de enzimas de restricción para permitir la inserción del fragmento de ADN.

Lleve un marcador genético seleccionable para distinguir las células huésped que las han absorbido de las que no lo han hecho.

exhibido por secuencias de reconocimiento - exhibe forma de simetría

pinchar. por luI y BalI cuando ambas hebras se cortan en el mismo par de nucleótidos creando fragmentos con extremos de doble hebra

ADN extracromosómico de doble hebra que se replica indep a partir de los cromosomas dentro de las células bacterianas

Los plásmidos se introducen en las bacterias mediante este proceso.

Método de tratamiento 1: tratamiento con iones de Ca y un breve choque térmico para impulsar el ADN en las células.

otra técnica: electroporación

Los fragmentos de restricción de ADN (del ADN que se va a clonar) se añaden al vector linealizado en pres. de ligasa

extremos cohesivos pegajosos recocidos, uniendo el ADN que se va a clonar y el plásmido

La ligasa de ADN se utiliza para crear enlaces fosfodiéster para sellar mellas en la columna vertebral del ADN, produciendo ADN recombinante.

la recomb. Luego, el ADN se introduce en el hospedador bacteriano mediante transformación.

si se inserta un fragmento de ADN en cualquier lugar del sitio de clonación múltiple, el gen lacZ se rompe y no producirá copias funcionales de b galactosidasa. Las bacterias transformadas en este experimento se colocan en placas de agar que contienen un antibiótico (ampicilina)

utilizado para escindir la lactosa disacárido en sus componentes monosacáridos glucosa y galactosa.

como resultado, las células bacterianas que llevan plásmidos no recombinantes (aquellas que se han autoligado y no contienen ADN insertado) tienen un gen lacZ funcional y producen b galactosidasa, que escinde x gal en el medio y estas células se vuelven azules.

Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias de fagos infecciosos, cada uno de los cuales lleva un inserto de adn.

número de copias muy grande, pero muy bajo pero bajo (tipo 1-2 copias / celda)

utilizado para clonar grandes fragmentos de ADN

tiene telómeros, ORI y centrómeros --- & gt estos componentes se unen a genes marcadores seleccionables y a un grupo de secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción para la inserción de ADN extraño

un vector de ADN, como un plásmido, que lleva una secuencia de ADN para la expresión de un gen insertado en ARNm y proteína en una célula huésped

Copias de ADN hechas a partir de moléculas de ARNm aisladas de cultivos de células o muestras de tejido, por lo tanto = la genética se expresa en la célula en el momento en que se creó la biblioteca.

- carecen de regiones no codificantes (intrones)

- solo incluye genes que se expresan en el tejido del que se aisló el ARNm

-también llamadas bibliotecas de expresión

método rápido de clonación de adn

Las copias de la secuencia de ADN específica a través de reacciones in vitro pueden amplificar las secuencias de ADN diana presentes en cantidades muy pequeñas.

requiere dos cebadores
1. Un complementario al extremo 5 ′
2. Otro complementario al extremo 3 ′

los cebadores se hibridan con el ADN desnaturalizado

Las hebras complementarias son sintetizadas por ADN polimerasa termoestable

un ciclo duplica la cantidad de moléculas de adn

es una técnica ampliamente utilizada en biología molecular para amplificar exponencialmente una sola copia o unas pocas copias de un segmento específico de ADN para generar de miles a millones de copias de una secuencia de ADN en particular.

Agregue algunos NTP, imprimación breve
secuencias, y termoestable
DNApol

Los cebadores se hibridan y permiten
DNApol para generar nuevas hebras

El ADN de doble hebra que se va a clonar es desnaturalizado en hebras simples. puede provenir de ADN genómico, restos momificados, fósiles, muestras forenses, etc.

calentamiento a 92-95 ° C durante aproximadamente 1 min

la temperatura de reacción se reduce a una temperatura de 45-65 grados C - & gt causa la unión del cebador (hibridación / hibridación) cebadores flanquean el adn --- & gt los cebadores son el punto de inicio para que el adn poli sintetice bases de composición

factores: longitud del cebador, composición base de los cebadores (los cebadores ricos en GC son térmicamente más estables que los cebadores ricos en AT)

Los cebadores pueden diseñarse para distinguir entre secuencias diana que difieren en un solo nucleótido: hace posible sintetizar sondas específicas de alelos para pruebas genéticas

Ubicación y naturaleza
de mutación puede ser
determinado rápidamente

Se pueden sintetizar sondas específicas de alelos para pruebas genéticas, lo que hace que la PCR sea importante para diagnosticar trastornos genéticos

metodología de diagnóstico clave para detectar bacterias y virus (HEP C VIH) en humanos y bacterias patógenas como E. coli y Staphylococcus aureus en alimentos contaminados

estudiar muestras de células individuales, fósiles o la escena de un crimen.

El ADN contiene miles de
estos sitios (muchos palindrómicos)

poderosa metodología para estudiar la expresión génica --- & gt / producción de ARNm por células o tejidos./

1. ARN aislado de células

2. La transcriptasa inversa se utiliza para generar ds-cDNA

3. PCR con cebadores para el gen de interés

Córtalo: enzimas de restricción

contaminaciones menores de la muestra de adn

Insertar el fragmento del genoma
En un organismo vivo y verlo crecer

Una vez que tenga suficiente, elimine
el organismo, guarda el ADN

la columna vertebral de fosfato de adn está muy cargada negativamente, por lo tanto, el ADN migrará en un campo eléctrico

método de separación de proteínas séricas por carga eléctrica

Movimiento de partículas en suspensión a través de un fluido o gel bajo la acción de una fuerza electromotriz aplicada a los electrodos en contacto con la suspensión.

-La agarosa, un copolímero de manosa y galactosa, cuando se derrite y se enfría, forma un gel poroso

-La columna vertebral de fosfato del ADN tiene una carga muy negativa, por lo tanto, el ADN migrará en un campo eléctrico

Proporciona información sobre la longitud del inserto clonado y la ubicación de los sitios de restricción dentro del clon; proporciona información / ubicación de los sitios de escisión de la enzima de restricción dentro del clon.

Metodología: Hibridación entre moléculas complementarias de ADN de ácido nucleico.

Realizado con cromosomas aislados en portaobjetos o in situ en cortes de tejido u organismos completos.

Útil cuando los embriones se utilizan para diversos estudios de genética del desarrollo.

factor limitante: llevar la sonda al sitio de destino qué células la absorberán y poder ver la fluorescencia

Didesoxinucleótido:
Desoxinucleótido con un hidrógeno en 3 ′ en lugar de un OH

ratones knockout tienen investigación revo

manipular el locus de alelos específicos o la secuencia de base y aprender su función en el gen de interés

Comparar secuencias es fundamental para comprender por qué los alelos varían en función.

Los didesoxinucleótidos detienen la polimerización del ADN en cada base, generando secuencias de varias longitudes que abarcan la secuencia original completa. Los fragmentos terminados se someten a electroforesis y se puede deducir la secuencia original.

un método de secuenciación de ADN basado en la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos que terminan la cadena por la ADN polimerasa durante la replicación del ADN in vitro

el adn a secuenciar se mezcla con un cebador que es complementario al adn o vector diana junto con dna plym y cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

llamados nucleótidos de terminación de cadena, ya que carecen del oxígeno necesario para formar un enlace fosfodiéster con otro nucleótido


Enzima de restricción HindIII

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Nucleasa

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Nucleasa, cualquier enzima que escinde los ácidos nucleicos. Las nucleasas, que pertenecen a la clase de enzimas llamadas hidrolasas, suelen tener una acción específica; las ribonucleasas actúan solo sobre los ácidos ribonucleicos (ARN) y las desoxirribonucleasas actúan solo sobre los ácidos desoxirribonucleicos (ADN). Algunas enzimas que tienen una acción general (como las fosfoesterasas, que hidrolizan los ésteres de ácido fosfórico) pueden denominarse nucleasas porque los ácidos nucleicos son susceptibles a su acción. Las nucleasas se encuentran tanto en animales como en plantas.

Las enzimas de restricción son nucleasas que dividen solo aquellas moléculas de ADN en las que reconocen subunidades particulares. Algunos dividen la molécula de ADN diana en sitios aleatorios (Tipo I), pero otros dividen la molécula solo en el sitio de reconocimiento (Tipo II) o a una distancia fija del sitio de reconocimiento (Tipo III). Las enzimas de restricción de tipo II y III son herramientas poderosas en la elucidación de la secuencia de bases en las moléculas de ADN. Desempeñan un papel fundamental en el campo de la tecnología del ADN recombinante o ingeniería genética.


Una enzima de restricción de Hemophilus influenzae : II. Secuencia base del sitio de reconocimiento ☆

Hemophilus influenzae La cepa Rd contiene una enzima, endonuolease R, que degrada específicamente el ADN extraño. Con el ADN del fago T7 como sustrato, la endonucleasa introduce un número limitado (aproximadamente 40) de roturas de doble hebra (5'-fosforilo, 3'-hidroxilo). El producto límite tiene una longitud promedio de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos y no contiene roturas de una sola hebra. Hemos explorado las secuencias de nucleótidos en los extremos 5 'del producto límite marcando los grupos 5' fosforilo (usando polinucleótido quinasa) y caracterizando los fragmentos marcados liberados por varias nucleasas. Se obtuvieron dos clases de secuencias 5′-terminales: pApApCpNp… (60%) y pGpApCpNp… (40%), donde N indica que la base en la 4ª posición no es única. Los monofosfatos de dinucleósido en los extremos 3 'se aislaron después de la digestión con nucleasa microcócica del producto límite y se identificaron como TpT (60%) y TpC (40%). Concluimos que la endonucleasa R de H. influenzae reconoce la siguiente secuencia de nucleótidos específica: 5 ′… pGpTpPy ¦pPupApCp… 3 ′ 3 ′… pCpApPup ¦PypTpGp… 5 ′ Se discuten las implicaciones de la doble simetría rotacional de esta secuencia.


Biología A-Level: Glosario

La biología de nivel A es mucho más fácil cuando conoce las definiciones de las palabras de uso común.

¡Un buen dominio de la terminología biológica puede significar la diferencia entre una mala calificación y una excelente! (Dado que, por supuesto, se obtienen calificaciones por utilizar el lenguaje técnico correcto en el contexto adecuado al responder las preguntas del examen).

. Por lo tanto, asegúrese de que aprender y revisar estas palabras biológicas esenciales y sus definiciones sea una parte integral de su Revisión de biología de nivel A.

Acetilo: Grupo químico derivado del ácido acético. Los grupos acetilo son importantes en el metabolismo y se agregan covalentemente a algunas proteínas como una modificación postraduccional.

Acetil CoA: grupo acetilo unido a la coenzima A (CoA). El acetil CoA es una pequeña molécula soluble en agua que transporta grupos acetilo en las células.

Acetilcolina: neurotransmisor que se encuentra en el cerebro y en el sistema nervioso periférico.

Receptor de acetilcolina: un canal de iones que se abre en respuesta a la unión de acetilcolina, lo que resulta en la conversión de una señal química en una eléctrica.

Hidrolasa ácida: Enzimas hidrolíticas (por ejemplo, proteasas, nucleasas, glicosidasas) con una actividad enzimática óptima a aproximadamente pH 5,0 (pH ácido). Enzimas hidrolasa y ácido se encuentran en lisosomas.

Tolerancia inmunológica adquirida: falta de respuesta del sistema inmunológico a un antígeno extraño determinado.

Vesícula acrosómica: la región en el extremo de la cabeza de un espermatozoide. El acrosoma contiene enzimas hidrolíticas que digieren la capa protectora del huevo.

Actina: La actina es una proteína abundante que forma filamentos de actina en todas las células eucariotas.

Filamento de actina: un filamento de proteína helicoidal. Una parte importante del citoesqueleto de todas las células eucariotas y parte de las proteínas contráctiles del músculo esquelético.

Proteína de unión a actina: la miosina es un ejemplo de una proteína de unión a actina, una proteína que se asocia con monómeros de actina o filamentos de actina en las células y modifica sus propiedades.

Potencial de acción (impulso nervioso): excitación eléctrica rápida, de corta duración y autopropagadora en la membrana plasmática de neuronas y células musculares. Los potenciales de acción son responsables de la señalización a larga distancia en el sistema nervioso.

Energía de activación: La energía & # 39extra & # 39 requerida para sufrir una reacción química particular.

Sitio activo: el sitio activo es la parte de una enzima a la que se une un sustrato para llevar a cabo una reacción catalizada.

Transporte activo: movimiento impulsado por la energía de una molécula a través de la membrana celular.

Respuesta inmune adaptativa: Respuesta del sistema inmune a un antígeno específico que genera memoria inmunológica.

Trifosfato de adenosina: ver ATP

ADP (difosfato de adenosina): un nucleótido que regenera ATP cuando se fosforila mediante un proceso de generación de energía, es decir, fosforilación oxidativa.

Adrenalina (epinefrina): hormona liberada por las células de las glándulas suprarrenales (y algunas neuronas) en respuesta al estrés. La adrenalina provoca la respuesta de "lucha o huida", p. Ej. aumento de la frecuencia cardíaca y los niveles de azúcar en sangre.

Aeróbico: proceso que requiere oxígeno (O2) o se produce en presencia de oxígeno gaseoso (O2).

Algas: eucariotas unicelulares y multicelulares que son organismos fotosintéticos, p. Ej. Nitella y Volvox.

Alcano: Un compuesto de carbono e hidrógeno que solo tiene enlaces covalentes simples, p. Ej. etano.

Alqueno: un hidrocarburo con uno o más dobles enlaces carbono-carbono, p. Ej. etileno.

Alelo: una forma alternativa de un gen, p. Ej. gen del color del pelaje alelo marrón o negro. En una célula diploide, cada gen tendrá dos alelos, cada uno ocupando la misma posición (locus) en los cromosomas homólogos.

Hélice alfa (y hélice alfa): un patrón de plegado helicoidal en la estructura secundaria de las proteínas donde una secuencia lineal de aminoácidos se pliega / se enrolla en una hélice a la derecha estabilizada por enlaces de hidrógeno.

Aminoácido: Molécula orgánica que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos son los monómeros de las proteínas.

Umbral anaeróbico: cuando los tejidos no pueden obtener suficiente oxígeno, las células comienzan a respirar anaeróbicamente. Por lo general, se aplica al ejercicio, p. Ej. & ldquothe corredor aumentó su velocidad de modo que cruzó el umbral anaeróbico y comenzó a acumular lactato & rdquo

Anticodón: Tres bases complementarias a un codón. Se encuentra en el ARNt, lo que le permite unirse al ARNm. El anticodón de GUG sería CAC.

Aorta: arteria principal del ventrículo izquierdo. Tiene la presión más alta de cualquier vaso sanguíneo.

Cuerpo aórtico: un parche de quimiorreceptores (células sensibles a cambios en los niveles de CO2 / H + en sangre). Ubicado en el arco aórtico, justo encima del corazón. Envía impulsos sensoriales a la médula. Véase también cuerpo carotídeo.

Vía Apoplasto: ruta del agua y los iones desde el agua del suelo hasta el xilema a través de las paredes celulares de las plantas y los espacios entre las células. Esta ruta no tiene vida y el agua / iones nunca cruzan una membrana, por lo que el plan no tiene control sobre la tasa de flujo. Contraste con la vía Symplast

Agricultura arable: cultivo de cultivos

Arteriola: vasos sanguíneos con una pared particularmente muscular. Puede vasodilatar (ensanchar) o vasoconstringir (estrechar) para controlar el flujo sanguíneo a un área en particular.

Arteria: vasos sanguíneos cuyas paredes tienen muchas fibras elásticas, por lo que tienen buenas propiedades de retroceso para resistir los aumentos de presión creados cuando el corazón late. Contraste con arteriola.

Atenuado: Habiendo reducido la virulencia vivos (debilitados), los organismos no patógenos se utilizan para activar la inmunidad adaptativa. Los organismos no patógenos administrados al individuo vacunado estimulan a los linfocitos para producir anticuerpos y células T activadas, sin producir enfermedad grave.

ATP: Adenosine Tri-Phosphate la célula y rsquos fuente inmediata de energía. En la respiración, la energía de la glucosa (o lípidos) se libera y se utiliza para producir ATP a partir de ADP y P. Una molécula de glucosa puede producir suficiente energía para producir hasta 36 moléculas de ATP, que luego se pueden utilizar para proporcionar energía a los músculos. contracción, transporte activo, síntesis de proteínas, etc.

Sístole auricular: contracción de las aurículas.

Atrio: cavidades superiores del corazón. Recibe sangre al corazón desde la vena cava y la vena pulmonar. Las atrias son básicamente cámaras de carga para los ventrículos, por lo que no necesitan paredes musculares gruesas.

Autosoma: cromosoma normal, no un cromosoma sexual. Los humanos tenemos 22 pares.

Válvula AV: válvulas entre las aurículas y los ventrículos del corazón, que evitan el reflujo hacia las aurículas. Nombres antiguos válvulas bicúspide y tricúspide.

AVN: nodo auriculoventricular. Parte vital de la vía de conducción en el corazón. Recibe impulsos de SAN, crea un retraso para permitir que los ventrículos se llenen y luego transfieren e impulsos por los haces de His.


Abstracto

Staphylococcus aureus muestra una estructura de población clonal en la que la transferencia horizontal de genes entre diferentes linajes es extremadamente rara. Esto se debe, en parte, a la presencia de un sistema de restricción-modificación (RM) de ADN de tipo I, dado el nombre genérico de Sau1, que mantiene diferentes patrones de metilación en secuencias diana específicas en los genomas de diferentes linajes. Hemos determinado las secuencias diana reconocidas por el Sau1 Los sistemas de RM de tipo I presentes en una amplia gama de los S. aureus linajes y asignaron las secuencias reconocidas a dominios de reconocimiento de diana particulares dentro de las enzimas RM. Usamos una variedad de ensayos bioquímicos en enzimas purificadas y secuenciación en tiempo real de una sola molécula en ADN genómico para determinar estas secuencias diana y sus patrones de metilación. Conocimiento de las principales secuencias diana para Sau1 facilitará la síntesis de nuevos vectores para la transformación de los linajes más prevalentes de esta bacteria "intransformable".


Resultados

Influencia del tipo de genoma viral en la evitación de RS

Los sistemas R-M generalmente solo se dirigen a moléculas de ADN de doble cadena. Sin embargo, también analizamos los valores de sesgo de composición para los bacteriófagos de ARN y ADN monocatenario. En la Tabla 3, presentamos solo los datos para RS palindrómico tipo II en virus procarióticos (conjunto de datos experimentales y conjunto de datos de control 1) y eucarióticos (conjunto de datos de control 2) con diferentes tipos de genomas. Las tablas análogas para los otros tipos de sistemas R-M y para RS asimétrico Tipo II se presentan en el archivo adicional 6. Estas tablas contienen algunos valores que podrían indicar una subrepresentación significativa del sitio. Sin embargo, comparten las tendencias de la Tabla 3 (ver más abajo) o parecen ser independientes de la presencia de sistemas R-M.

Las fracciones de RS con una frecuencia observada reducida (CB & lt 1) difieren significativamente entre los tres conjuntos de datos (uno experimental y dos controles) en el caso de los virus dsDNA y ssDNA, pero este no es el caso de los virus dsRNA y ssRNA (Tabla 3, figura 1). Esto indica claramente la existencia de una presión selectiva sobre RS en los genomas de bacteriófagos de ADN pero no en los genomas de fagos de ARN. La diferencia significativa entre las fracciones con CB & lt 1 y CB & gt 1 en el conjunto de datos de control 1 no puede explicarse completamente por la inclusión del conjunto de datos experimentales. Esto podría significar la presencia de una gran cantidad de bacteriófagos que cumplen con los correspondientes sistemas R-M, pero no tenemos datos sobre estas interacciones. La ligera desviación de las fracciones de control viral eucariotas del 50% podría deberse a algún papel funcional de los sitios palindrómicos de 4-6 pb no relacionados con la actividad de los sistemas R-M.

Porcentajes de sitios con un número reducido de ocurrencias en los genomas virales de diferentes tipos. Los círculos azules son para el conjunto de datos experimental, los cuadrados rojos son para el conjunto de datos de control 1 (control viral procariótico) y los diamantes grises son para el conjunto de datos de control 2 (control viral eucariótico)

La evitación observada en el caso de bacteriófagos de ssDNA podría reflejar la influencia del sistema R-M durante la etapa bicatenaria de su ciclo de vida. Cabe señalar que las fracciones de RS con CB & lt 1 difieren de forma fiable entre los fagos de dsDNA y ssDNA. Sólo se seleccionaron fagos de dsDNA para el análisis posterior debido a que los datos de los fagos de ssDNA eran insuficientes en la mayoría de los casos estudiados.

Efecto de tipo REase en la evitación de RS

Analizamos por separado REases Tipo I, Tipo IIG, Tipo II ortodoxo, Tipo IIM, Tipo III y Tipo IV. Para este propósito, dividimos nuestros conjuntos de datos por tipo de REase. Las fracciones sustancialmente aumentadas de RS con recuentos reducidos (CB & lt 1) se observaron solo para dos tipos de REase: tipo II ortodoxo y tipo IV (ver Fig. 2). Tenga en cuenta que, en el caso del tipo IV, esto es cierto solo para CB & lt 1 pero no para la representación insuficiente (CB & lt 0.8, consulte el párrafo siguiente).

Porcentajes de RS con número reducido de ocurrencias calculados para los diferentes tipos de sistemas R-M. Las designaciones son las mismas que en la Fig.1

Calculamos histogramas de valores CB para los subconjuntos de los conjuntos de datos experimentales y de control para diferentes tipos de sistemas R-M (Fig. 3). Los histogramas demuestran que solo el subconjunto Tipo II se enriquece significativamente para los sitios subrepresentados. Es decir, hay un 27,2% de sitios subrepresentados de sistemas ortodoxos de tipo II R-M y menos del 5% de dichos sitios para otros tipos de sistemas R-M. La fracción de RS eliminada (CB & lt 0.1) es 7.1% para los sistemas R-M Tipo II y menos del 0.5% para los sistemas R-M de los otros tipos.

Histogramas de valores de sesgo de composición para diferentes tipos de sistemas R-M. Las líneas azules punteadas corresponden a los subconjuntos del conjunto de datos experimental, las líneas rojas continuas son para el conjunto de datos de control 1 y las líneas continuas grises son para el conjunto de datos de control 2

Nuestro conjunto de datos experimentales incluye una fracción significativa de RS predicho que no se verificaron experimentalmente. Las anotaciones erróneas de RS pueden resultar en fracciones reducidas de RS infrarrepresentadas. Sin embargo, las fracciones de sitios eliminados y subrepresentados para RS probada son similares a las fracciones para RS predicha. Hay 34,5 y 3,3% de sitios subrepresentados entre los RS comprobados de Tipo II y los otros tipos, en consecuencia. Las fracciones análogas de los sitios eliminados entre los RS comprobados son 7.1 y 0.3%, respectivamente.

En los casos de RS Tipo I y Tipo IIG, no hay una diferencia significativa entre las distribuciones de los valores CB para los conjuntos de datos experimentales y de control (Figuras 2 y 3). Por tanto, es probable que no exista una presión selectiva contra los sitios de Tipo I y IIG en los genomas del fago, o al menos tal presión no es lo suficientemente fuerte y estable para inducir la evitación de RS.

Para RS de Tipo III, la diferencia entre las distribuciones experimental y de control es casi imperceptible en las Figs. 2 y 3. Sin embargo, las fracciones de sitios de Tipo III con CB & lt 1 y CB & lt 0.8 difieren significativamente entre los conjuntos de datos experimentales y de control (pag-valor & lt 0.008 en todos los casos, prueba exacta de Fisher). Esto se debe a una fracción menor (aproximadamente el 5%) de los sitios de Tipo III que están infrarrepresentados en los genomas del fago. Sin embargo, la evitación de RS no parece ser una estrategia anti-restricción considerable en el caso de los sistemas R-M Tipo III. Tenga en cuenta que las fracciones de los sitios de Tipo III sobrerrepresentados también difieren significativamente en los conjuntos de datos experimentales y de control.

El histograma para el subconjunto Tipo IIM del conjunto de datos Experimental (Fig.3) demuestra que la fracción de sitios con CB & gt 1.1 son levemente, pero significativamente, más grandes que las fracciones correspondientes de ambos conjuntos de datos de control (pag-valor & lt 1e-10 en cada caso, prueba exacta de Fisher). La lista de RS Tipo IIM incluye nueve palindrómicos y cinco asimétricos. El porcentaje de pares (genoma, sitio asimétrico) en la fracción Tipo IIM del conjunto de datos experimental es solo del 6,0% y, por lo tanto, los sitios asimétricos no pueden afectar significativamente el histograma observado. Todos los sitios palindrómicos de tipo IIM son también sitios de reconocimiento de algunos sistemas ortodoxos de tipo II R-M. Las fracciones de genomas con CB & lt 1 varían significativamente para diferentes sitios: 100% para GATC, 88.5% para GCNNGC, 66.3% para GCWGC y solo 22.5% para GCNGC (otros cinco RS Tipo IIM conocidos no están presentes en nuestro conjunto de datos experimental) . El sitio GCNGC exhibe pares que forman un bulto en el CB

1.1 área del histograma (Fig. 3). Tal sobreabundancia de sitios GCNGC en los genomas de fagos parece no estar relacionada con los sistemas R-M porque las fracciones con CB & gt 1 para GCNGC también son grandes en ambos controles (60,7% en el conjunto de datos de control 1 y 93,6% en el conjunto de datos de control 2).

La mayoría (91,4%) de los sitios de Tipo IV tienen CB & lt 1, pero para la mayoría de ellos CB está cerca de 1 (ver Fig. 3). Solo hay dos RS Tipo IV diferentes que cumplen con nuestros criterios, SCNGS e YCGR. Ambos sitios son bastante pequeños, ricos en GC y tienen fuertes intersecciones con los sitios comunes de Tipo II CCNGG y CCGG, respectivamente. El conjunto de datos de control de virus eucariotas, a diferencia del conjunto de datos de control de bacteriófagos, contiene fracciones casi idénticas de sitios de Tipo IV que son más frecuentes y menos frecuentes de lo esperado. Esto sugiere que la diferencia observada podría estar relacionada con la actividad del sistema R-M.

Evitación de RS en genomas de fagos con diferentes estilos de vida

Comparamos histogramas de valores CB para RS tipo II ortodoxo en genomas de bacteriófagos de ADN templados y no templados (Fig. 4a). Las fracciones de sitios con números reducidos (CB & lt 1) y significativamente reducidos (CB & lt 0,8) de ocurrencias son similares para fagos templados y no templados. Sin embargo, los fagos templados tienen una fracción notablemente menor de RS que se eliminan de sus genomas (CB & lt 0,1). Tales diferencias pueden deberse al período de profago, durante el cual un sesgo extremo de la composición de oligonucleótidos no proporciona ninguna ventaja selectiva.

Fracciones de sitios de Tipo II con diferentes valores de CB. La altura de la barra corresponde a la fracción de sitios con el número reducido (CB & lt 1), la parte coloreada es para sitios con CB & lt 0.8, y la parte rayada indica la fracción con CB & lt 0.1. "Control" representa el subconjunto del conjunto de datos de control I con sitios de tipo II y genomas de dsDNA. a Comparación de virus dsDNA templados y no templados. B Comparación de los colifagos con o sin el gen de la hidroximetilasa (HM)

Fagos con mecanismos anti-restricción

Estimamos cómo otros mecanismos anti-restricción podrían influir en la evitación de RS. Usamos colifagos de la familia Myoviridae como un ejemplo conveniente. Algunos fagos de la familia codifican una enzima anti-restricción (ADN hidroximetilasa), que modifica el ADN genómico y, por lo tanto, previene la escisión del ADN por las REasas. Otros fagos relacionados no codifican esta enzima [29]. La Figura 4b muestra que cinco fagos con un mecanismo anti-restricción de este tipo evitan (CB & lt 0.8) solo el 2.4% de la E. coli RS, mientras que el 55,8% de dichos sitios se evitan en los genomas de cuatro colifagos de la misma familia que no codifican la ADN hidroximetilasa.


INTRODUCCIÓN

Las endonucleasas de restricción de tipo II reconocen secuencias de ADN específicas y escinden el ADN en ubicaciones específicas dentro o adyacentes a sus sitios de reconocimiento, en reacciones que normalmente solo requieren Mg 2+ como cofactor (1 - 3). En muchos casos, la secuencia de reconocimiento es un palíndromo simétrico de 4 a 8 pares de bases consecutivos, aunque algunos reconocen palíndromos discontinuos, interrumpidos por un segmento de longitud especificada pero secuencia no especificada (4, 5). Muchas de las enzimas que actúan en los sitios palindrómicos son dímeros que interactúan simétricamente con sus objetivos, colocando un sitio activo en cada hebra del ADN: p. Ej. EcoRI, EcoRV y BamHI (6). Normalmente cortan ambas hebras durante la vida útil del complejo enzima-ADN (7 - 9). Los enlaces fosfodiéster escindidos por estas enzimas generalmente se ubican dentro de la secuencia: en algunos casos, cerca de los extremos 5 ′, para dejar dúplex con extensiones 5 ′ de una sola hebra, en otros, en el medio del sitio, para dejar dúplex con extremos alineados in further cases, near the 3′ ends. However, a subset of the Type II systems, called Type IIS ( 5 ), recognize asymmetric sequences and cleave both strands at specific locations on one side of the recognition site. Another subset, the Type IIB enzymes, also cut the DNA at specified positions distant from their recognition sites, but on both sides of the sequence.

The myriad applications of these enzymes in molecular biology ( 10 ) have driven extensive searches for new nucleases with novel specificities. At present, more than 3500 Type II enzymes have been identified from many different species of bacteria, and these encompass about 240 distinct recognition sequences ( 4 ). Hence, in many instances, two or more enzymes from different species have a common recognition site. In these instances, the first enzyme found to recognize a particular sequence is known as the prototype, while others that cleave the same sequence are called isoschizomers. Some isoschizomers cleave at different positions from the prototype and these are called neoschizomers ( 5 ). With the exceptions of certain isoschizomers, the Type II endonucleases show little similarity in amino acid sequence ( 11 ), apart from some residues that bind the Mg 2+ ions needed for catalysis ( 12 – 14 ). Nevertheless, restriction enzymes with dissimilar amino acid sequences often have similar core structures ( 3 , 6 ). Isoschizomers can, however, be virtually identical to each other, with >50% amino acid identity ( 15 , 16 ), but some isoschizomers lack any similarity in primary sequence ( 17 ). Neoschizomers are expected to deviate from the prototype, since they must position their active sites against the DNA differently ( 12 ), but this re-positioning need not involve radically different architectures. For example, EcoRV and BglI cleave DNA to leave flush-ended or 3′-extended fragments, respectively, yet the individual subunits in these two enzymes are very similar: they differ only at the subunit interface ( 18 ) and operate by similar mechanisms ( 19 ).

The restriction enzymes often taken to represent the Type II systems, such as EcoRV and BamHI, act at individual copies of their recognition sites ( 2 , 3 ). But many restriction enzymes become active only after interacting with two copies of the target sequence ( 2 , 20 , 21 ). The Type II enzymes that need two sites include some that cleave at a palindromic sequence ( 22 – 30 ), others (the Type IIS enzymes) that act adjacent to asymmetric sites ( 31 – 34 ), and still others (the Type IIB enzymes) on both sides of their targets ( 35 ). A number of the restriction enzymes that interact with two sites, the Type IIE systems, use one copy of the sequence to activate the enzyme to cleave a second copy: these enzymes are usually dimers but with two functionally distinct DNA-binding clefts one with the catalytic functions for DNA cleavage and one for the activator ( 22 , 25 ). After interacting with two sites, a Type IIE enzyme cuts just one of the sites ( 31 , 36 ). For another group of enzymes that interact with two sites, the Type IIF systems, the interaction leads to the concerted cleavage of the DNA at both sites ( 20 , 21 ). The Type IIF enzymes usually act as tetramers ( 37 ), with two identical DNA-binding clefts, each made of two subunits, but they seem to have virtually no activity until both clefts are filled with cognate DNA ( 38 ).

The Type I and the Type III restriction endonucleases need to interact with two copies of their recognition site for most—or all—of their DNA cleavage reactions ( 21 , 39 ), since these often require the collision of two enzyme molecules bound to separate sites after they have pushed the intervening DNA into expanding loops ( 39 ). The same applies to most enzymes that restrict methylated DNA ( 39 ). Amongst the Type II enzymes, the majority of the Type IIS enzymes ( 31 ), and almost all of the Type IIB enzymes (J. J. T. Marshall, D. M. Gowers and S. E. Halford, unpublished data), display full activity only after binding two copies of their recognition site. But it has yet to be established what fraction of the Type II enzymes with palindromic sites need two sites. To address this question, we examined seven Type II endonucleases that all cleave DNA at one palindromic sequence, 5′-GGCGCC-3′. The reason for selecting these enzymes is that this particular sequence is cleaved at a greater variety of positions than any other hexanucleotide site for the Type II enzymes ( 4 ): the cleavage points in this sequence include four of the five internal phosphodiester bonds. The seven enzymes were tested against DNA substrates with one or two copies of this sequence, to determine whether they need to bind to two sites and, if so, how many phosphodiester bonds are cleaved per turnover.


Understanding the immutability of restriction enzymes: crystal structure of BglII and its DNA substrate at 1.5 Å resolution

Restriction endonucleases are remarkably resilient to alterations in their DNA binding specificity. To understand the basis of this immutability, we have determined the crystal structure of endonuclease BglII bound to its recognition sequence (AGATCT), at 1.5 Å resolution. We compare the structure of BglII to endonuclease BamHI, which recognizes a closely related DNA site (GGATCC). We show that both enzymes share a similar α/β core, but in BglII, the core is augmented by a β-sandwich domain that encircles the DNA to provide extra specificity. Remarkably, the DNA is contorted differently in the two structures, leading to different protein–DNA contacts for even the common base pairs. Además, el BglII active site contains a glutamine in place of the glutamate at the general base position in BamHI, and only a single metal is found coordinated to the putative nucleophilic water and the phosphate oxygens. This surprising diversity in structures shows that different strategies can be successful in achieving site-specific recognition and catalysis in restriction endonucleases.


Ver el vídeo: Enzimas de restricción (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Wayde

    No absolutamente necesario para mí. ¿Quién más, qué puede pedir?

  2. Welles

    Creo que estas equivocado. Hablemos de esto.

  3. Rabican

    ¡Muy buena publicación! ¡Gracias por el trabajo que has hecho!

  4. Tojasho

    Definitivamente tiene razón

  5. Mekazahn

    Estas cosas útiles son diferentes)) Karoch Prikona

  6. Arth

    Maravilloso, es algo precioso



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