Información

¿Qué son los métodos estereológicos, similares al análisis de área de Saltykov, pero específicamente para cortes histológicos paralelos y equidistantes?

¿Qué son los métodos estereológicos, similares al análisis de área de Saltykov, pero específicamente para cortes histológicos paralelos y equidistantes?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

He leído estereología cuantitativa, de Underwood, y el análisis de área de Saltykov funciona bien para mi investigación, pero me sorprende que no haya nada para cortes de histología paralelos equidistantes. ¿Existen métodos específicos para este caso?


Sondas de diodos para el control óptico espacio-temporal de múltiples neuronas en animales que se mueven libremente

Dirección para solicitudes de reimpresión y otra correspondencia: E. Stark, Center for Molecular and Behavioral Neuroscience, Rutgers Univ., 197 Univ. Ave., Newark, NJ 07102 (correo electrónico: [email & # 160protected]).

Centro de Neurociencia Molecular y del Comportamiento, Universidad de Rutgers, Newark, Nueva Jersey

Centro de Neurociencia Molecular y del Comportamiento, Universidad de Rutgers, Newark, Nueva Jersey


Expresiones de gratitud

Agradecemos a Brita Zugenmaier por la corrección de pruebas y a los colegas del Centro de Medicina Experimental Walter Brendel (Ludwig ‐ Maximilians ‐ Universität München, Alemania), en particular a Franz Singer por su apoyo técnico con respecto al equipo quirúrgico, y a Mehdi Shakarami, jefe de instalaciones para animales, y su personal para la competencia en alojamiento de animales. En particular, agradecemos a Sven Reese (Instituto de Anatomía, Histología y Embriología, Ludwig ‐ Maximilians ‐ Universität München, Alemania) por el asesoramiento estadístico y la introducción al método de estadísticas de tamaño del efecto según Cohen.

Recursos de fondos

Este trabajo fue apoyado en parte por el Collaborative Research Center (SFB ‐ TR) 127, el Excellence Cluster Cardio ‐ Pulmonary System (ECCPS) de la Justus ‐ Liebig ‐ University, Giessen (Alemania), y la subvención individual FI ‐ 543/2 ‐2, todos financiados por la Fundación de Investigación Alemana (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn, Alemania), así como por la Fundación von ‐ Behring ‐ Röntgen (Marburg, Alemania) y el Programa Prioritario LOEWE “Medical RNomics” (Wiesbaden, Alemania) .


¿Qué son los métodos estereológicos, similares al análisis de área de Saltykov, pero específicamente para cortes histológicos paralelos y equidistantes? - biología

Una evaluación cuantitativa de las características morfológicas de las células BeWo como modelo in vitro de células trofoblásticas humanas


Una Evaluaci & oacuten Cuantitativa de las Caracter & iacutesticas Morfol & oacutegicas de las C & eacutelulas BeWo como un Modelo in vitro de las C & eacutelulas de Trofoblasto Humano

* C.S. Abaidoo ** M. A. Warren ** P. W. Andrews y amp *** K. A. Boateng

* Departamento de Anatomía, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Ciencia y Tecnología Kwame Nkrumah, Kumasi, Ghana.

** Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Sheffield, Sheffield, S10 2TN, Reino Unido.

*** Departamento de Patología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Ciencia y Tecnología Kwame Nkrumah, Kumasi, Ghana.

RESUMEN: Para estudiar la morfología detallada de las células trofoblásticas durante la implantación humana, se cultivaron células BeWo como esferoides en cultivo en suspensión. A continuación, estos cultivos se procesaron para un examen microscópico óptico y electrónico. El presente estudio mostró que los esferoides BeWo consisten en dos tipos de células que son similares a citotrofoblasto y similares a sincitiotrofoblasto. Las células con un diámetro nuclear más grande constituían solo alrededor del 1% de la población celular y parecen ser las del sincitiotrofoblasto. Por lo tanto, el tipo de célula predominante de los esferoides BeWo parecía ser relativamente indiferenciado y de tipo citotrofoblasto. Aproximadamente el 10% de las células BeWo en el presente estudio eran mitóticas, lo que indica una población altamente proliferativa. El número total de células aumentó aproximadamente 12 veces durante el período de cultivo, de 107 y más 9 el día 1 a 1211 y más de 145 el día 7, mientras que el volumen por célula aumentó aproximadamente 2 veces, de 1300 y microm3 el día 1 a 2400 y microm3 el día 7. Por lo tanto, en general El crecimiento de los esferoides de BeWo se debe tanto a la hiperplasia como a la hipertrofia. Sin embargo, parece que la proliferación celular supera al crecimiento volumétrico. Estos datos cuantitativos muestran que las células BeWo crecen principalmente por hiperplasia y proporcionan valores de referencia para estudios posteriores. Además, los resultados muestran que la morfología de las células BeWo tiene similitudes marcadas con la reportada para el trofoblasto humano, lo que lo convierte en un modelo útil para estudios in vitro posteriores.

Palabras clave: Esferoides de morfometría de trofoblasto de BeWo.

RESUMEN: En un cultivo de suspensi & oacuten se estudi & oacute; la morfolog & iacutea de las c & eacutelulas durante la implantaci & oacuten del trofoblasto humano, c & eacutelulas BeWo. Estos cultivos fueron procesados ​​y examinados a trav & eacutes de microscop & iacutea de luz y electr & oacutenica. El estudio mostr & oacute que los esferoides BeWo constan de dos tipos de c & eacutelulas, citotrofoblasto y sincitiotrofoblasto. Las c & eacutelulas con mayor di & aacutemetro nuclear parecen ser los sincitiotrofoblasto que representaban s & oacutelo el 1% de la poblaci & oacuten celular. Por tanto, el tipo celular predominante de los esferoides BeWo parec & iacutean ser relativamente indiferenciados como citotrofoblasto. Alrededor del 10% de las c & eacutelulas BeWo fueron mit & oacuteticas, lo que indica una poblaci & oacuten altamente proliferativa. El n & uacutemero de c & eacutelulas totales aument & oacute alrededor de 12 veces durante el per & iacuteodo de cultivo de 107 & plusmn 9 d & iacuteas en el d & iacutea 1 a 1211 & plusmn 145 en el d & iacutea 7, mientras que el volumen de la c & eacutelula creci & oacute; n alrededor de 2 veces, desde 1300 mm3 el d & iacutea 1 hasta 2400 mm3 el d & iacutea 7. Por lo tanto, el crecimiento global de esferoides BeWo se debe tanto a la hiperplasia como a la hipertrofia. Sin embargo, parece que la proliferaci & oacuten celular supera al crecimiento volum & eacutetrico. Estos datos cuantitativos muestran que las c & eacutelulas BeWo crecen principalmente por hiperplasia y proporcionan valores de referencia para estudios posteriores. Adem & aacutes, los resultados muestran que la morfolog & iacutea celular BeWo ha marcado similitudes con los reportado para el trofoblasto humano, por lo que es un modelo & uacutetil para posteriores estudios in vitro.

Palabras clave: BeWo Trofoblasto Morfometr & iacutea Esferoides.

INTRODUCCIÓN

La implantación humana depende de una serie de interacciones específicas entre las células trofoblásticas tempranas del blastocisto y el endometrio. Sin embargo, dado que los estudios sistemáticos in vivo son prácticamente imposibles en el ser humano, existe una necesidad creciente de modelos de cultivo de tejidos adecuados. Dado que los principales eventos de implantación ocurren en la primera parte del embarazo, es probable que el tejido placentario del primer trimestre sea la fuente más útil de células trofoblásticas para estudios in vitro (Aplin, 1996). Desafortunadamente, la recuperación de cantidades suficientes de placenta humana normal del primer trimestre para tales estudios plantea problemas tanto éticos como técnicos. Además, las células de citotrofoblasto aisladas del primer trimestre de gestación no pueden propagarse fácilmente en cultivo (Irving et al., 1995 Frank et al., 2001 Abaidoo & amp Warren, 2008).

Un enfoque alternativo es examinar, in vitro, la interacción de los embriones de FIV y quotspare con el endometrio.

Si bien se puede permitir el uso de embriones de FIV para estudios de observación, todavía existen importantes dificultades éticas y prácticas en su uso. Por ejemplo, los embriones & quotspare & quot a menudo se clasifican como menos que óptimos (ya que no se usaron / seleccionaron para reemplazo). Además, algunos de ellos pueden haber estado congelados durante muchos años, lo que puede afectar su comportamiento. También es probable que haya muy pocos disponibles para el tipo de investigación cuantitativa necesaria. Estos y otros problemas han limitado el estudio de las primeras células trofoblásticas humanas en proceso de implantación. Sin embargo, la similitud de las células de coriocarcinoma humano en cultivo en monocapa con las células de trofoblasto humano normal en términos de morfología y producción de hormonas (Pattillo et al., 1971) ha permitido a algunos investigadores utilizar estas células para estudiar algunas de las propiedades del trofoblasto in vitro.

La línea de células tumorales trofoblásticas humanas BeWo se estableció en cultivo en 1966 (Pattillo & amp Gey, 1968) a partir de un coriocarcinoma posparto que había sido trasplantado en serie en la bolsa de la mejilla del hámster por Hertz (1959). Gr & uumlmmer et al. Han informado de su morfología y diferenciación básicas en cultivos monocapa. (1994). Se ha sugerido que la línea celular BeWo consiste en células similares a citotrofoblasto y células gigantes multinucleares que parecen sincitiotrofoblasto (Gr & uumlmmer et al., 1990). Gr & uumlmmer et al. (1990, 1994) han establecido en cultivo esferoides multicelulares BeWo que tienen algunas características morfológicas y secreciones hormonales similares a los cultivos en monocapa de BeWo y a las células citotrofoblasto humano normales in vivo.

Los estudios in vitro de estas líneas de células trofoblásticas humanas pueden proporcionar alguna información sobre las primeras etapas de la implantación humana. Si bien existe una gran cantidad de informes que tratan de las secreciones hormonales de las células BeWo, parece haber poca información publicada sobre la ultraestructura y las características de crecimiento de estas células, en particular datos morfométricos objetivos. Por lo tanto, con el fin de proporcionar una mejor comprensión de los cambios en el tamaño de las células BeWo, el complemento de los orgánulos (y, por lo tanto, la función celular) que se producen durante el crecimiento del esferoide, el presente estudio se diseñó para establecer datos de referencia detallados sobre la morfología de las células BeWo cultivadas en cultivo en suspensión. utilizando microscopía óptica cuantitativa. Más específicamente, las características de crecimiento de los esferoides BeWo se investigaron utilizando técnicas cuantitativas objetivas como parte de una investigación sobre un posible modelo in vitro para células trofoblásticas humanas y también para hacer comparaciones entre métodos morfométricos basados ​​en modelos y basados ​​en diseño de estimación de volumen y número. para realizar comparaciones con los datos publicados.

Material y método

Cultivos de células BeWo. Las células de coriocarcinoma (BeWo, Human CCL, American Type Culture Collection Pattillo y Gey, 1968) se cultivaron de forma rutinaria como monocapas mediante pases seriados en Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco Life Technologies Limited, Paisley, Escocia) a 37 ° C en 1% dióxido de carbono y aire al 95% en frascos de cultivo celular de 25 ml (Costar, EE. UU.). Las células se subcultivaron mediante dispersión con 0,5% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Sigma Chemicals Company, Reino Unido) a temperatura ambiente durante 2 y 3 minutos con interrupción mecánica intermitente para ayudar al proceso de disociación. Se utilizó un microscopio de contraste de fase (Cambridge Instruments, Reino Unido) para controlar el desprendimiento de las células BeWo. En dos minutos, las células se habían desprendido del matraz y se añadieron cinco mililitros de medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco con medio de cultivo Hams F12 (DMEM-F12, Gibco Life Technologies Limited, Paisley, Escocia) para detener la disociación adicional de las células. Se sembraron dos mililitros de la suspensión de células individuales en cada matraz de cultivo celular de 25 ml que contenía 5 ml de medio de cultivo DMEM-F12, los matraces se taparon sin apretar y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. El medio de cultivo se cambió cada 48 y 72 horas. Los procedimientos anteriores se llevaron a cabo en condiciones asépticas en una cabina de cultivo de tejidos de clase II (Gelaire BSB4 A, Gelman SPA, Flow General, Rickmansworth, Inglaterra).

Preparación de esferoides de células BeWo. Para iniciar el cultivo de esferoides, se recogieron las células en crecimiento utilizando tripsina al 0,5% / EDTA a temperatura ambiente (como anteriormente). Las células se suspendieron en medio de cultivo DMEM-F12 y se añadieron aproximadamente 7 x 105-1 x 106 células en 10-15 ml de DMEM F12 a placas de Petri estériles de grado no para cultivo de tejidos (90 mm de diámetro) y se colocaron en una incubadora. a 37 ° C en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 16 y 24 horas. El medio se cambió cada 48 horas. Los inóculos grandes dieron como resultado un desarrollo más rápido de esferoides, mientras que el uso de números más bajos tomó más tiempo para que crecieran los esferoides.

Procesamiento de tejidos para microscopía óptica. La suspensión de esferoides de células BeWo se transfirió a tubos de centrífuga y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga de mesa (Jouan, Francia). Se eliminó el sobrenadante y se añadieron aproximadamente 5 ml de glutaraldehído al 3% precalentado en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) al sedimento restante que contenía los esferoides BeWo durante 4-6 horas. Los esferoides de células BeWo se deshidrataron luego a través de soluciones secuenciales de etanol (70%, 80%, 90%, 100%) durante veinte minutos en cada cambio centrifugando a 1000 rpm y eliminando el sobrenadante en cada paso. Los esferoides se retiraron, junto con algo de etanol, en moldes de plástico. El etanol se recogió utilizando una pipeta Pasteur con una punta muy fina y luego se añadió la solución de inclusión de JB4 a los esferoides. Los esferoides flotaron durante un tiempo y luego se asentaron en la base del molde. Los moldes se cubrieron con soportes metálicos y se dejaron polimerizar durante 24 horas en condiciones anaeróbicas. Algunos de los esferoides deshidratados se aclararon en cloroformo durante 30 minutos, se infiltraron en cera durante una hora y se incrustaron en cera durante la noche.

Se cortaron secciones de aproximadamente 2 y micras de espesor de cada bloque JB4 utilizando cuchillas de vidrio seco fabricadas. Las secciones se aplanaron flotando sobre la superficie del agua a temperatura ambiente, se recogieron en portaobjetos de microscopio limpios y se secaron en una placa calefactora a 60 ° C. Los portaobjetos se tiñeron con Fuschin de ácido acuoso al 1% teñido por contraste con azul de toluidina al 0,05% o con azul de toluidina al 1% solo. Todos los portaobjetos se examinaron con un microscopio óptico.

Los bloques de cera se seccionaron a aproximadamente 5 µm y se tiñeron en eosina acuosa al 1%.

Procesamiento de tejidos para microscopía electrónica. Algunos de los esferoides fijados como se describió anteriormente se procesaron para microscopía electrónica incrustándolos en Epon usando procedimientos estándar (Warren & amp Bedi, 1984). Se cortaron secciones ultradelgadas de color plata-oro de interferencia (aproximadamente 50-70 nm de espesor) de los mismos bloques que los descritos anteriormente usando cuchillos de vidrio y se recogieron en rejillas de cobre de malla 200 de 3,05 mm que se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. se examinaron y se tomaron micrografías utilizando un microscopio electrónico de transmisión Philips 301 a un voltaje de aceleración de 60 kv. Los negativos se observaron utilizando un microscopio de proyección.

Medida del espesor de la sección. El grosor de algunas de las secciones semifinas cortadas con el ultramicrotomo se midió utilizando un microinterferómetro (microscopio de interferencia Vickers Patholux). Con este instrumento se hizo pasar un haz de luz monocromática de longitud de onda de 546 nm a través de la sección y se midió la diferencia de trayectoria óptica (OPD) con referencia a una región de fondo vacío.

El espesor de la sección (t) se obtuvo a partir de:

t = OPD l / & micro m - & micro a (Goldstein y amp Hartmann-Goldstein, 1974)

OPD = diferencia de trayectoria óptica en fracción de longitud de onda

l = longitud de onda de la luz utilizada

& micro m = índice de refracción de los medios (1,51)

& micro a = índice de refracción del medio en el que se realizan las medidas (1,00)

El valor obtenido de cada sección se utilizó en los cálculos apropiados para las densidades numéricas y el cálculo de volumen como se describe a continuación.

Medición del diámetro de esferoides BeWo. Los diámetros mayor y menor de cada esferoide se obtuvieron tomando medidas perpendiculares del diámetro del esferoide en cada uno de los 8 esferoides seleccionados al azar usando un microscopio óptico de contraste de fase invertido equipado con una retícula de ocular calibrada. A intervalos de 24 horas, se midieron los esferoides y se volvieron a poner en cultivo. Los esferoides se fijaron después de siete días, se procesaron y seccionaron como se describe anteriormente. Los diámetros mayor y menor de la sección más central de cada esferoide se midieron en las secciones semifinas. Se encontró que el tamaño de muestra de 8 era óptimo a partir de un estudio piloto.

Morfometria

Estimaciones de fracción de volumen. La fracción de volumen (Vv) de núcleo a célula se estimó utilizando una técnica de conteo de puntos (Williams, 1977) y una red cuadrada de 5 micras (la separación de puntos en el tejido es de 6,2 micras) con la ayuda de un tubo de extracción conectado a una Olympus. (BH-2) microscopio. Para cada portaobjetos de tejido se examinaron al menos cinco campos de visión muestreados al azar sistemáticamente que no se superponían. La celosía cuadrada se superpuso sobre la imagen del tejido y se registró el número de puntos que caen sobre los núcleos y el número total de puntos que caen sobre las células enteras (Weibel, 1979). La fracción de volumen de núcleo a célula se calculó mediante la fórmula:

Pn = número total de puntos en los núcleos, y

Pc = número total de puntos en las celdas.

Estimación de los diámetros del perfil nuclear de las células BeWo. Los diámetros mayor y menor de los perfiles nucleares de BeWo se midieron utilizando un tubo de dibujo conectado a un microscopio Olympus (BH-2) y una tableta digitalizadora conectada a un microordenador utilizando software escrito previamente (Warren & amp Bedi). Las mediciones se realizaron bajo inmersión en aceite con un aumento de X 810, determinado usando un micrómetro de platina. El diámetro medio del perfil nuclear y su relación axial se calcularon a partir de los valores de los dos ejes utilizando las ecuaciones:

diámetro medio = & divide (a & yen b) (Warren & amp Bedi),

donde a = diámetro del perfil mayor y

b = diámetro del perfil menor.

Relación axial = (diámetro del perfil mayor) / (diámetro del perfil menor)

donde 1.0 = un perfil circular.

Estimación del área y volumen del esferoide de células BeWo. El volumen de los esferoides BeWo se estimó utilizando el Principio de Cavalieri (Mayhew, 1991). Se cortó una pila de secciones paralelas a través de los esferoides con una separación de aproximadamente 5 micras (ajuste del micrótomo) entre las secciones sucesivas. El espesor de cada una de las secciones seriadas se midió mediante interferometría. Las secciones se seleccionaron sistemáticamente de la pila de secciones, tomando cada décima sección desde un comienzo aleatorio (Mayhew). La fracción de muestreo fue predeterminada a partir de un estudio piloto. Con la ayuda de un tubo de dibujo unido a un microscopio, se estimaron las áreas de los esferoides BeWo con un aumento de X 810 usando una técnica de conteo de puntos y una retícula cuadrada de 5 mm (la separación de puntos en el tejido fue de 6,2 micras). Se registró el número de puntos que caen en cada esferoide celular y se calcularon las áreas y volúmenes de los esferoides usando la siguiente ecuación (Mayhew):

SP = número total de puntos de prueba que caen sobre el esferoide, y a (p) = el equivalente de área de un punto de prueba (distancia entre los puntos en la cuadrícula / el aumento),

d = intervalo / distancia entre las secciones que se obtuvo de la suma de los espesores de sección de las secciones intermedias.

Estimación de la densidad numérica de núcleos de células BeWo utilizando:

El método Disector. La densidad numérica de núcleos en los esferoides de células BeWo se estimó utilizando el método disector. Este método requiere una serie de secciones paralelas, con una distancia conocida entre sí, para ser cortadas a través de la muestra (Sterio, 1984 Gundersen, 1986). Se cortó una pila de secciones semifinas a través de una muestra de esferoides de la que se eligieron pares de secciones (Disectores). Dentro de cada Disector, la primera sección se designó como la sección de referencia y la segunda sección como la "búsqueda". La recopilación de datos para los esferoides se llevó a cabo en el analizador de imágenes Quantimet 970 (Cambridge Instruments Ltd).

Se utilizaron doce pares de secciones semifinas teñidas con azul de toluidina para cada esferoide. Se utilizaron un total de 6 esferoides. Los 12 disectores se tomaron de las secciones seriadas en un patrón de muestreo aleatorio sistemático. La imagen de la sección de referencia (por ejemplo, la sección 2) se proyectó en una pantalla y los perfiles nucleares de todos los núcleos dentro del marco de muestreo se trazaron sobre láminas de acetato utilizando un bolígrafo soluble en agua. Como había un núcleo por célula, el núcleo se utilizó como unidad de recuento de la célula. El proceso se repitió para la sección de "búsqueda" (por ejemplo, la sección 3). La hoja de acetato con el contorno de los perfiles nucleares de la sección de referencia se superpuso a la imagen de la sección de 'búsqueda' y el número de perfiles de cada núcleo visto en la sección de referencia pero no visto en la sección de búsqueda fue contados y representados como Q-. Con el fin de mejorar la eficiencia del procedimiento, se repitió el recuento en las mismas dos secciones pero en la dirección inversa del primer recuento: es decir, contando el número de perfiles faltantes en la sección 3 (ahora la sección de referencia) desde el 'look- up '(sección 2) (Gundersen, 1986). En el presente estudio se utilizaron 12 Disectores en cada dirección para un total de 24 Disectores. El número de disectores fue predeterminado a partir de un estudio piloto. La densidad numérica de los núcleos de las células BeWo (Nv) se estimó mediante la fórmula (modificada de Sterio, 1984):

SQ- = suma de los perfiles nucleares presentes en la sección de referencia pero que faltan en la sección de 'búsqueda',

A = área promedio del perfil esferoide,

Sh = suma de la distancia entre la sección de referencia y la sección de 'búsqueda' para cada disector

El método Dehoff & amp Rhines. La densidad numérica de núcleos en los esferoides de células BeWo también se estimó utilizando el método DeHoff & amp Rhines (1961), un método tradicional basado en modelos. Se utilizó una sección semifina teñida con azul de toluidina de cada uno de los esferoides BeWo. Un marco de conteo insesgado de área conocida (Gundersen, 1977 Weibel) se superpuso sobre la imagen del esferoide y se registró el número de perfiles presentes en el marco de conteo y se determinó el número por unidad de área. Sólo se contaron los perfiles de partículas que no tocaban las líneas de exclusión (Calverley et al., 1988). Las medidas del diámetro medio de los perfiles nucleares de BeWo se obtuvieron utilizando el digitalizador, como se describió anteriormente. Las estimaciones del diámetro medio del perfil obtenido anteriormente dan una subestimación del diámetro medio verdadero del perfil, por lo que se aplicó el procedimiento de corrección del diámetro de Schwartz-Saltykov (Williams, 1977) y se obtuvo el diámetro medio corregido de las partículas. La densidad numérica se obtuvo mediante la siguiente fórmula:

Na = número de perfiles por unidad de área

H = diámetro medio de la pinza

t = espesor de la sección (ver más abajo)

La densidad numérica de las celdas BeWo se calculó de 3 formas usando (i) el espesor de sección medido, (ii) el espesor de sección asumido de 0,5 mm y (iii) asumiendo que el espesor es insignificante (Williams).

Estimación del número de células de BeWo basada en:


El disector. Los perfiles nucleares faltantes (Q-) se contaron como se describió anteriormente. La densidad numérica se estimó a partir de la fórmula dada anteriormente y el Nv se multiplicó por el volumen del esferoide (Vs) para obtener el número total de células en el esferoide.

Número total de células = Nv x Vs

El fraccionador. El número de células BeWo por esferoide se estimó utilizando el fraccionador (Mayhew). Los perfiles nucleares faltantes se contaron en los mismos pares de secciones utilizadas para el Disector. El recuento de células se realizó en ambas direcciones como se describió anteriormente. La distancia h entre las secciones paralelas y el volumen de los esferoides no son necesarios para este método porque todas las células del esferoide estaban disponibles para el muestreo. Se utilizó una fracción de muestreo de 1/5. El esquema de muestreo utilizado en este estudio se empleó solo en el primer nivel de fraccionamiento, ya que los esferoides eran lo suficientemente pequeños como para seccionarlos completamente en serie sin necesidad de submuestreo. La estimación del número (N) se obtuvo de:

f = recíproco de la fracción de muestreo.

Recuento directo de células esferoides. Los esferoides se retiraron en diferentes momentos del cultivo, se midieron usando una retícula de ocular y se desagregaron por incubación con tripsina / EDTA al 0,25%. El número de células en estas suspensiones monodispersas simplemente se contó directamente con la ayuda de un microscopio de disección (Wild M32, Heerbrugg, Suiza). El procedimiento se repitió estimando el número de células usando un hemocitómetro (Neubauer mejorado, Hausser Scientific Partnership, Horsham, EE. UU.) De la forma estándar.

Determinación del número de células mitóticas. Se llevaron a cabo recuentos simples de perfiles de células mitóticas con un aumento de aproximadamente X 1000 con un marco de recuento insesgado (Gundersen, 1977). El marco de conteo se superpuso sobre la imagen del esferoide. Se contaron y registraron el número de perfiles de células mitóticas y el número total de perfiles de células en el marco. Cada esferoide se muestreó sistemáticamente. Luego se calculó la proporción de células mitóticas. Se obtuvieron índices mitóticos para cada esferoide, estos se combinaron y se calcularon las medias y los errores estándar por experimento.

Análisis estadístico. Los valores individuales se agruparon dentro de los grupos y se calcularon las medias y los errores estándar para cada grupo. Los datos de la fracción de volumen y la relación axial del perfil nuclear se sometieron a transformaciones logarítmicas para hacer que los valores fueran adecuados para el análisis estadístico. Los datos sobre los diámetros, el volumen y la densidad numérica del perfil nuclear se probaron directamente. Los datos se analizaron utilizando pruebas t de Student emparejadas o no emparejadas según fuera apropiado para comparar las diferencias entre 2 grupos y se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para examinar las diferencias en el diámetro del esferoide a lo largo del tiempo en cultivo.

Las estimaciones numéricas obtenidas por el fraccionador y las derivadas de la combinación del principio de Cavalieri y el método del disector se sometieron a una prueba de correlación. Los datos no transformados se presentan en las tablas.

Fracción de volumen (Vv) de célula ocupada por núcleo. Las fracciones de volumen de la célula BeWo ocupada por el núcleo se dan en la Tabla I.El Vv fue numéricamente mayor en los esferoides BeWo de 7 días (D7) que en los esferoides de 1 día (D1), pero esto no fue significativo en P 0,05. El coeficiente de variación de esta característica en los esferiodos D1 (5%) fue similar al del grupo D7 (4%).

Dimensiones del perfil nuclear y relación axial del perfil nuclear. Las dimensiones del perfil nuclear de las células D7 eran mayores (P & lt 0,001) que las de los esferoides D1 (Tabla I). La relación axial del perfil nuclear de los dos grupos fue notablemente similar. Los coeficientes de variación de la relación axial para los esferoides D1 y D7 fueron los mismos (3%).

Diámetro medio de los esferoides. Durante el período de cultivo, el diámetro (medido directamente) de los esferoides aumentó (P & lt 0,001, ANOVA) linealmente desde una media de 103 & plusmn 26 & microm el día uno hasta 361 & plusmn 33 & microm el día 7. El diámetro medio después de la fijación y el procesamiento de los esferoides de 7 días de edad fue 315 & plusmn 28 & microm. Esto fue significativamente (P & lt 0,001) más bajo (en un 13%) que el diámetro medio del esferoide de 361 & plusmn 33 & microm obtenido por medición directa. Hubo una fuerte correlación positiva (r = 0,998 P & lt 0,01) entre el diámetro del esferoide de los dos métodos.

Volumen de esferoides. Las estimaciones de volumen para esferoides de 1 y 7 días de edad tanto para los métodos basados ​​en el diseño como en los modelos se dan en la Tabla II. El volumen medio de los esferoides de 7 días fue de 2,6 y más de 0,4 x 10-3 mm3. Esto fue significativamente (P & lt 0.01) mayor que el volumen medio de los esferoides de 1 día de edad (1.4 & plusmn 0.2 x 10-4 mm3). Las estimaciones de volumen de esferoides obtenidas por el método basado en modelos aumentaron significativamente (P & lt 0.01) de 1.7 & plusmn 0.6 x 10-3 mm3 a 2.9 & plusmn 1.0 x 10-2 mm3. Los coeficientes de variación de esta característica para las estimaciones basadas en modelos fueron aproximadamente el doble de los de las estimaciones basadas en el diseño.

Estimaciones de densidad numérica. La densidad numérica media para los esferoides fijados después de 7 días en cultivo fue significativamente (P & lt 0,001) más baja que la de los esferoides D1 (Tabla II). Los valores medios para los esferoides de 1 y 7 días de edad de los métodos DeHoff & amp Rhines y Disector se comparan en las Tablas III y IV. La densidad numérica media de los esferoides D1 obtenidos por el método DeHoff & amp Rhines fue de 2,96 y más de 0,19 x 105 mm-3. Esto fue significativamente (P & lt 0,001) más bajo (en un 63%) que el valor de Disector de 7,95 & plusmn 0,59 x 105 mm-3 (Tabla III). No hubo correlación entre los datos de las dos técnicas (Tabla III).

Para los esferoides de 7 días, la densidad numérica obtenida por el método Disector, utilizando una sección supuesta.

El espesor de 0.5 & microm (3.21 & plusmn 0.25 x 105 mm-3) fue significativamente (P & lt 0.01) menor que el obtenido usando el espesor de sección medido (4.96 & plusmn 0.34 x 105 mm-3) (Tabla IV). De manera similar, el Nv de los esferoides D7 obtenidos por el método DeHoff & amp Rhines, usando el espesor de sección medido fue significativamente (P & lt 0,001) menor (1,56 & plusmn 0,14 x 105 mm-3), en comparación con el valor de Disector de 4,96 & plusmn 0,34 x 105 mm-3 (Tabla IV). El Nv obtenido por el método DeHoff & amp Rhines usando un espesor de sección asumido de 0.5 & microm (1.54 & plusmn 0.14 x 105 mm-3) también fue significativamente (P & lt 0.01) más bajo que el del método Disector (3.21 & plusmn 0.25 x 105 mm- 3) pero no hubo correlación entre estos resultados (Tabla IV).

La densidad numérica media derivada por el método DeHoff & amp Rhines asumiendo que el espesor de la sección es despreciable, el espesor de la sección medido y el espesor de la sección supuesta fueron 1.60 & plusmn 0.14 x 105 mm-3, 1.56 & plusmn 0.14 x 105 mm-3 y 1,54 & plusmn 0,14 x 105 mm-3 respectivamente (Tabla V). Esto resultó en reducciones significativas (P & lt 0,001) del 68%, 69% y 69% en comparación con el valor de Disector de 4,96 y más de 0,34 x 105 mm-3.

Estimaciones numéricas. Las estimaciones numéricas obtenidas al combinar el método Disector con el principio de Cavalieri para la determinación del volumen en los esferoides D1 y D7 fueron 107 & plusmn 9 y 1211 & plusmn 145 respectivamente (Tabla VI) y los valores fueron significativamente (P & lt 0,001) diferentes. Las estimaciones numéricas obtenidas por el método del fraccionador fueron 108 & plusmn 9 (D1) y 1070 & plusmn 60 (D7), que también fue significativamente (p & lt 0,001) diferente. Para los esferoides de 1 y 7 días de edad, las estimaciones numéricas obtenidas con las dos técnicas no difirieron significativamente (P) y hubo una fuerte correlación positiva (r = 0,850 P & lt 0,05) entre los resultados de las dos técnicas. Sin embargo, las estimaciones numéricas derivadas del método DeHoff & amp Rhines fueron significativamente más bajas que las obtenidas por los métodos basados ​​en el diseño (43 y más 8 para D1 y 415 y más 86 para D7). Los coeficientes de variación de esta característica para las estimaciones basadas en modelos fueron aproximadamente el doble de los de las estimaciones basadas en el diseño.

El presente estudio ha examinado la morfología detallada de una línea celular de coriocarcinoma BeWo utilizando un sistema de cultivo donde las células crecen en esferoides. Este parece ser el primer estudio de la determinación del volumen y el número de células de BeWo utilizando métodos morfométricos basados ​​en el diseño. Se realizaron comparaciones entre métodos morfométricos basados ​​en diseño y basados ​​en modelos. Se observaron diferencias importantes entre las estimaciones obtenidas por estos dos métodos morfométricos.

Los resultados cuantitativos y cualitativos del presente estudio mostraron que los esferoides BeWo consisten en dos tipos de células, células similares a citotrofoblasto y células similares a sincitiotrofoblasto, con las células de mayor diámetro nuclear que constituyen solo alrededor del 1% de la población celular. These appear to be syncytiotrophoblast-like cells. The predominant cell type of the BeWo spheroids appeared to be relatively undifferentiated and cytotrophoblast-like. This finding is in agreement with previously published reports although their conclusions were based on qualitative analyses. Aplin reported that the BeWo cell line is heterogenous with a population of approximately 1% multinuclear giant cells.

About 10% of the BeWo cells in the present study were mitotic indicating a highly proliferative population. Grümmer et al. (1990) used the bromo-deoxyuridine anti-bromo-deoxyuridine technique to detect proliferating cells in BeWo spheroids. The authors reported that proliferating cells were distributed all over spheroids at all stages of cell division and in class sizes of spheroids up to 520 µm in diameter. Cell proliferation in human trophoblast cells (Genbacev et al., 1993) has been assessed using proliferative cell nuclear antigen (PCNA) antibodies specific for dividing cells (Waseem & Lane, 1990). Genbacev et al. (1993) have shown that cytotrophoblast cells of the cell columns or clusters, some villous cytotrotrophoblast cells, and migrating extravillous trophoblast (EVT) cells from tissue explants of anchoring villi are PCNA positive. However, nuclei of syncytiotrophoblast and EVT cells outside the cell columns remained unstained (Okudaria et al., 1991). The proliferative capacity of cyto-trophoblast cells has also been assessed using a different antibody raised against dividing cell nuclear antigen Ki67 (Castellucci et al., 1991 Genbacev et al., 1992). The localization and distribution of Ki67 antigen in first trimester placentae has been reported to be the same as that for PCNA (Genbacev et al., 1993 Hermes et al., 2008). Therefore, it appears that under both in vivo and in vitro conditions migrating cytotrophoblast cells, cytotrophoblast cells in clusters, and BeWo cells retain proliferative activity.

The volume fraction of BeWo cells occupied by nucleus was not significantly different in the D7 and D1 spheroids although the nuclear profile dimensions were significantly larger in D7 cells compared with D1 cells. This was due to a corresponding increase in cytoplasmic volume during 7 days in culture as confirmed by cell volume estimates. Increased nuclear profile diameter often reflects increased transcription in the nucleus (Junqueira et al., 1992).

In the present study, determination of nuclear profile dimensions was made in order to assess the changes in size and shape of the BeWo cells during the culture period. In addition, it was used in combination with volume fraction estimates to make comparisons about both nuclear changes and alterations in other parts of the cell, such as in relative cytoplasmic or overall cell volume. While it is recognized that the nuclear profile diameter has its limitations as a direct estimator of nuclear dimensions, it was found in the present study that it was useful for interpreting Vv data. Grümmer et al. (1990) reported a "high nuclear to cytoplasm ratio" when BeWo cells were put in suspension culture compared with monolayer BeWo cultures. Their conclusions were made on purely qualitative basis whereas in the present study Vvs were estimated by point counting techniques and the nuclear profile dimensions measured directly.

The present data show a significant increase in diameter between the D1 and D7 spheroids. These results are in agreement with some published reports. Grümmer et al. (1990) reported on the effect of time in culture on the diameter of BeWo spheroids grown in suspension culture. The sizes of the spheroids in their study were bigger (226 ± 49 µm on day 1 and 524 ± 117 µm on day 9) than those of the present study. In another study Grümmer et al. (1994) reported that after 11 days in culture the mean diameter was 500 µm for BeWo, 660 µm for Jeg-3, and 1000 µm for JAr spheroids. White et al. (1988) grew JAr cells in suspension culture and reported that the diameter of the spheroids increased with time in culture from a mean of 125.1 ± 8.8µm on day 5 to a mean of 841.3 ± 76µm on day 15. The differences between values obtained in these studies and the present study was probably due to differences in content of FCS, 10% (White et al. 1988) and 15% (Grümmer et al., 1990, 1994) compared with 2.5% used in the present study. However, Yuhas & Li (1978) reported that multicellular spheriod growth rates remained identical when the FCS concentration of the medium was varied between 2 and 10%.

Other investigators (Yuhas & Li Landry et al., 1982) have reported that spheroids from other cell types such as fibrosarcoma induced by methylcholanthrene in a C3H mouse (FSA) and a radiation induced mammary carcinoma from a BALB/c mouse (MCa-11) enlarge exponentially for a few days and then continue on a linear growth curve before reaching a critical diameter beyond which there is no further increase in size.

Some necrotic cells were found scattered in the spheroids in the present study, but there was no evidence of a central zone of necrosis. In addition the BeWo spheroids had small cavities which were devoid of cells adjacent to and surrounded by areas of viable cells. It is likely that the diffusion of nutrients and metabolites was still sufficient to support all cells at this stage and so few cells died by necrosis. The observation of intercellular cavities within the spheroids together with the scarce scattered pattern of necrosis formation are similar to the findings of Grümmer et al. (1990) and White et al., although in the latter study JAr cells and not BeWo cells were used. Development of central necrosis has been shown to vary considerably in spheroids of different cell lines although in most spheroid systems a central necrotic core begins to develop at diameters greater than 250 µm (Soranzo et al., 1986 White et al.). For example, V79 spheroids of more than 250 µm in diameter develop a necrotic core (Grümmer et al., 1990) while spheroids of other cell lines such as spheroids of human bladder carcinoma origin could reach diameters of about 500 µm or even 700 µm before central necrosis occurred in them (Erlichman & Tannock, 1986 Hermes et al.).

Various cellular and extracellular processes such as hyperplasia, cellular hypertrophy, and interstitial growth may contribute to BeWo spheroid growth. Changes in spheroid diameter are not adequate for the detection of subtle changes in spheroids. Therefore, BeWo spheroid volume was estimated using a design-based morphometric method. A simple model-based method was also used in order to compare the results obtained in the present study to published reports. Spheroid volume estimates using Cavalieri's method increased, about 20 times between 1 and 7 days in culture, from 1.4 ± 0.2 x 10-4 mm3 to 2.57 ± 0.4 x 10-3 mm3. These were about 10 times lower than the estimates derived by the model-based method (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3). Model-based volume estimates obtained in the present study are in broad agreement with those of earlier studies (White et al. Grümmer et al., 1990, 1994), but differ in detail there was a general increase in spheroid volume and spheroid growth was linear over the culture period. However, model-based volume estimates obtained in the present study (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3) are lower than those of previous studies (6 x 10-3 mm3 to 7.5 x 10-2 mm3, reported by Grümmer et al., 1990). In these reports, unfixed spheroids were used and measurements were obtained from a phase contrast microscope fitted with an eyepiece graticule.

The reliability of model-based methods depends on how closely the model mimics the real object. The traditional model-based volume methods used by these investigators as a means of quantifying the growth of BeWo, Jar, and Jeg-3 spheroids rely on perpendicular measurements of spheroid diameter and calculation of the volume using the equation V = 4/3pr3, which assumes that the spheroids are perfect spheres. However, BeWo spheroids differ in shape and often deviate considerably from sphericity. In addition, since the formula used for the volume estimates used the radius as part of the product, it is sensitive to even small changes in diameter. Therefore, the results obtained by this method are likely to be, at least to some extent, inaccurate and unreliable.

In order to make improved estimates of volume, it is necessary to use appropriate stereological methods of proven reliability and accuracy (Mayhew et al., 1990). The Cavalieri principle as used in this study combines a point counting technique with section thickness measurements and does not require assumptions about object shape or spatial orientation (Mayhew). The great advantage of this method is that it is design-based and not model-based and offers unbiased estimates free of simplistic and often erroneous assumptions. Application of the Cavalieri principle to a wide variety of tissues and organs has demonstrated high efficiency and reliability, although it has been reported to be time-consuming and labour-intensive (Mayhew et al., 1990).

Mayhew, 1991 and others have shown that the volume of anything which can be recognized unequivocally from its profiles can be determined by generating slices and estimating volumes from the slices. The two requirements of the Cavalieri principle are (i) a complete set of parallel sections through the entire object and the mean distance between the sections must be available, (ii) the slices are selected in a systematic random manner. The Cavalieri principle has been used to estimate the volume of brain (Mayhew et al., 1990) multicellular colon carcinoma spheroids (Bauer et al., 1995) and breast tumor volume (Ladekarl et al., 1997). These authors reported that the Cavalieri principle is an efficient, reproducible and unbiased method.

Mayhew et al. (1990) have shown that, for physical slices, the volume obtained by fluid displacement correlates extremely well with Cavalieri volume estimates. Weibe & Laursen (1995) estimated the volume of human lung using both the Cavalieri's principle and fluid displacement. They concluded that both methods are reliable, with Cavalieri's principle being superior. Therefore the Cavalieri-based volume estimates from the present study are likely to be reliable and accurate.

The growth within BeWo spheroids were also assessed using design-based stereological methods. The results of the present study show that the volume of the spheroids increased with time in culture. The question then arises as to whether the increase is due to hypertrophy of the cells or hyperplasia. Growth within the spheroids was monitored as total number of nuclei (a measure of nuclear proliferation) and volume per nucleus (a measure of hypertrophy). The latter was estimated by calculating the volume of the spheroid associated with each nucleus qualitative light and electron microscopic studies showed cells to be mononuclear.

There was a significant decrease (38%) in the numerical density of BeWo cell nuclei after 7 days in culture. It is likely that an increase in the overall volume containing the cells contributed to the observed decrease in numerical density of the day 7 BeWo spheroids compared with the day 1 spheroids.

The results of the present study demonstrate that total cell number increased about 12 times during the culture period whereas the volume per cell increased about 2 times, from 1300 µm3 on day 1 to 2400 mm3 on day 7 (combining spheroid Cavalieri volume estimates and total cell number obtained by the Fractionator method). Therefore overall growth of BeWo spheroids is due to both hyperplasia and hypertrophy. However, it appears that cell proliferation outstrips volumetric growth. The present study shows that BeWo cells proliferate and that some of the cells are lost by necrosis. However, this loss is replaced by mitosis and that the total number of cells actually increases.

Grümmer et al. (1990) used a haemocytometer to determine the cell number in BeWo multicellular spheroids. They reported that the number of cells per spheroid increased from 813 at a volume of 6 x 10-3 mm3 to 8913 cells at a volume of 7.5 x 10-2 mm3. Simpson et al. (1992) and Mayhew et al. (1994) using human placentae, also showed that trophoblast, stroma, and endothelial cells proliferate from the first trimester of pregnancy to term. They concluded that placental growth occurs, wholly or in part, by hyperplasia. Therefore the present study appears to support the notion that during gestation, cytotrophoblast cells proliferate thereby contributing to the increasing volume of the placenta.

So far nothing appears to have been reported in the literature about the use of quantitative techniques to estimate the number of cells present in BeWo spheroids. Estimates of the number of cells obtained by the Fractionator method was numerically lower for D1 spheroids and higher for D7 spheroids when compared with those obtained by the haemocytometer and the dissecting microscope. However, the estimates obtained by combining the Disector method and the Cavalieri's principle for volume estimation were not significantly (P 0.05) different from the Fractionator values.

The great advantage of the combined Cavalieri principle and the Disector method is that they are both design-based and not model-based. Mayhew et al. (1994) studied the growth of the human placenta during gestation using numerical density estimates based on the Disector and the corresponding volume estimates. West & Gundersen (1990) used this technique to estimate the number of neurons in the human hippocampus. Ladekarl et al. (1997) estimated the total number of cancer cell nuclei in breast cancer tumors using the optical Disector and the volume of the tumor (estimated by the Cavalieri principle). They concluded that the estimates obtained by this technique are unbiased and highly reproducible.

There was no correlation between the results obtained by the Disector and the model-based method in the present study. The reasons for this remain unclear but it appears to suggest that as well as producing different absolute values, the two methods are different in distribution estimates. Similar results were obtained by Akbar (1991) in the nervous system.

Comparison of numerical density values for D7 spheroids obtained by the Disector was made using both assumed (0.5µm) and measured section thicknesses. These results showed that the numerical density estimates based on the assumed section thickness were consistently lower, compared with values based on the measured section thickness. Since the measured section thickness was found to be consistently less than the assumed section thickness, the lower numerical density estimates was as predicted. The importance of accurately determining section thickness is therefore apparent, especially for the Disector where it contributes to the product in the denominator. In contrast, the Fractionator does not require the thickness of the individual sections.

As above, the results for the DeHoff & Rhines method showed estimates using measured section thickness to be consistently lower than those where t = 0 but numerically marginally higher compared with values based on the assumed section thickness. This was entirely to be expected from the formula used for the numerical density estimation. Also the correlation of the data based on the three section thicknesses was excellent.

As mentioned above, the Disector and the Cavalieri methods for volume estimation both require serial sectioning and knowledge of the distance between the sections, usually found from the true section thickness. It is therefore necessary to measure the exact thickness of the sections being used for both methods. In the present study section thicknesses were measured by interferometry. This method was chosen because of its accuracy and reproducibility (Goldstein & Hartmann-Goldstein Williams). A drawback of this method, however, is that sections have to be measured before staining and mounting. A solution to this problem was reported by Bedi (1987). He showed that a light vertical cut can be made on one side of the face of the block dividing it into small and large portions. The smaller piece is collected and its thickness measured while the larger one is stained and mounted for the appropriate measurement.

It is well documented that the true thickness of sections is often different from the microtome setting (Bedi Akbar, 1991 Warren, 1992). Such differences may be due to variations in mechanical and thermal changes and compression during sectioning (Mori & Christensen, 1980 Ohno, 1980). Using interferometry, the measured section thickness of semi-thin Araldite-embedded sections (mean 0.44µm, range 0.16-0.80µm) and ultra-thin (mean 54.4 nm, range 43.4-71.2 nm) were found to be an underestimate of the microtome setting (0.5 µm) (Warren, 1992). The estimation of section thickness from interference colours has also been reported to be subject to large and inconsistent errors (Williams, 1977). Neither the advance setting of the ultramicrotome nor the evaluation of section thickness by observing the reflected light interference colour can be relied upon. Therefore the actual section thickness of sections for quantitative studies must be verified by measurement.

In conclusion, these quantitative data show that BeWo cells grow mainly by hyperplasia and provide baseline values for further studies. In addition, the results show that BeWo cell morphology has marked similarities to that reported for human trophoblast, making it a useful model for subsequent in vitro studies. Furthermore results of the present study reinforce the need to base conclusions on objective unbiased estimates rather than traditional model-based methods.


Abaidoo, C. S. & Warren, M. A. Morphological And Behavioural Features Of BeWo Cells Grown On Matrigel Offers A Model For Human Cytotrophoblast Cells During Early Implantation. J. of Science and Technology, 28(1):4-16, 2008. [ Links ]

Akbar, G. N. K. A quantitative histological study on the brain morphology of rats reared artificially and subjected to different environmental conditions. Ph.D Thesis. The University of Sheffield, 1991. [ Links ]

Aplin, J. D. The cell biology of human implantation. Placenta, 17(5-6):269-75, 1996. [ Links ]

Bauer, J. Gries, W. & Bahmer, F. A. Volume estimation of multicellular colon carcinoma spheroids using Cavalieri's principle. Pathol. Res. Pract., 191(12):1192-7, 1995. [ Links ]

Bedi, K. S. A simple method of measuring the thickness of semi-thin and ultra-thin sections. J. Microsc., 148(1): 107-12, 1987. [ Links ]

Calverley, R. K. S. Bedi, K. S. & Jones, D. G. Estimation of the numerical density of synapses in rat neocortex. J. Neurosci. Methods, 23:195-205, 1988. [ Links ]

Castellucci, M. Classen-Linke, I. Mülhauser, J. Kaufmann, P. Zardi, L. & Chiquet-Ehrismann, R. The human placenta: a model for tenascin expression. Histochemistry, 95(5):449-58, 1991. [ Links ]

DeHoff, R. T. & Rhines, F. N. Determination of the number of particles per unit volume from measurements made on random plane sections: the general cylinder and the and the ellipsoid. Soy. Inst. Min. and Met. Eng., 221:975-96, 1961. [ Links ]

Erlichman, C. & Tannock, I. F. Growth and characterization of multicellular tumor spheroids of human bladder carcinoma origin. In vitro Cell Dev. Biol., 22:449-56, 1986. [ Links ]

Frank, H. G. Morrish, D. W. Pötgens, A. Genbacev, O. Kumpel, B. & Caniggia, I. Cell culture models of human trophoblast: primary culture of trophoblast--a workshop report. Placenta, 22:S107-9, 2001. [ Links ]

Genbacev, O. Schubach, S. A. & Miller, R. K. Villous culture of first trimester human placenta-model to study extravillous trophoblast (EVT) differentiation. Placenta, 13:439-61, 1992. [ Links ]

Genbacev, O. Jensen, K. D. Powlin, S. S. & Miller, R. K. In vitro differentiation and ultrastructure of human extravillous trophoblast (EVT) cells. Placenta, 14:463-75, 1993. [ Links ]

Goldstein, D. J. & Hartmann-Goldstein, L. J. Accuracy and precision of a scanning and integrating microinterferometer. J. Microsc., 102:143-64, 1974. [ Links ]

Grümmer, R. Hohn, H. P. & Denker, H.W. Choriocarcinoma cell spheroids: an in vitro model for the human trophoblast. Trophoblast. Res., 4:97-111, 1990. [ Links ]

Grümmer, R. Hohn, H. P. Mareel, M. M. & Denker, H. W. Adhesion and invasion of three human choriocarcinoma cell lines into human endometrium in a three-dimensional organ culture system. Placenta, 15(4):411-29, 1994. [ Links ]

Gundersen, H. J. G. Notes on the estimation of the numerical density of arbitrary profiles: the edge effect. J. Microsc., 111:219-223, 1977. [ Links ]

Gundersen, H. J. Stereology of arbitrary particles. A review of unbiased number and size estimators and the presentation of some new ones, in memory of William R. Thompson. J. Microsc., 143:3-45, 1986. [ Links ]

Hermes, C. Azevedo, J. F. Araujo, E. J. A. & Santana, D. M. G. Intestinal Ascending Colon Morphometrics in Rats Submitted to Severe Protein Malnutrition. En t. J. Morphol., 26(1):5-11, 2008. [ Links ]


Abaidoo, C. S. Warren, M. A. Andrews, P. W. & Boateng, K. A. A quantitative assessment of the morphological characteristics of BeWo cells as an in vitro model of human trophoblast cells. En t. J. Morphol., 28(4):1047-1058, 2010. [ Links ]

Hertz, R. Choriocarcinoma of women maintained in serial passage in hamster and rat. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 102:77-80, 1959. [ Links ]

Irving, J. A. Lysiak, J. J. Graham, C. H. Hearn, S. Han, V. K. & Lala, P. K. Characteristics of trophoblast cells migrating from first trimester chorionic villus explants and propagated in culture. Placenta, 16(5):413-33, 1995. [ Links ]

Junqueira, L. C. Carneiro, J. & Kelley, R. O. Basic Histology. 7ª ed. Norwalk, Appleton and Lange, 1992. pp.25-6. [& # 160Links & # 160]

Ladekarl, M. Jensen, V. & Nielsen, B. Total number of cancer cell nuclei and mitoses in breast tumors estimated by the optical disector. Anal. Quant. Cytol. Histol., 19(4):329-37, 1997. [ Links ]

Landry, J. A. Freyer, J. P. & Sutherland, R. M. A model for the growth of multicellular spheroids. Cell Proliferation, 15:585-94, 1982. [ Links ]

Mayhew, T. M. Mwamengele, G. L. M. & Dantzer, V. Comparative morphometry of the mammalian brain: estimates of cerebral volumes and cortical surface areas obtained from macroscopic slices. J. Anat., 172:191-200, 1990. [ Links ]

Mayhew, T. M. The new stereological methods for interpreting functional morphology from slices of cells and organs. Exp. Physiol., 76:639-65, 1991. [ Links ]

Mayhew, T. M. Wadrop, E. & Simpson, R. A. Proliferative versus hypertrophic growth in tissue subcompartments of human placental villi during gestation. J. Anat., 184:535-43, 1994. [ Links ]

Mori, H. & Christensen, K. Morphometric analysis of Leydig cells in the normal rat testis. J. Cell Biol., 84:340-54, 1980. [ Links ]

Ohno, S. Morphometry for determination of size distribution of peroxisomes in thick sections by high voltage electron microscopy. In: studies of section thickness. J. Electron Microsc., 29:230-5, 1980. [ Links ]

Okudaria, Y. Matsui, Y. & Kanoh, H. Morphological variability of human trophoblasts in normal and neoplastic conditions. In: Soma, H. (Ed). Placenta: Basic Research for Clinical Application. International conference on Placenta, Tokyo, Basel - Karger, 1991. pp.171-87. [& # 160Links & # 160]

Pattillo, R. A. & Gey, G. O. The establishment of a cell line of human hormone-synthesizing trophoblastic cells in vitro. Cancer Res., 28:1231-6, 1968. [ Links ]

Pattillo, R. A. Gey, G. O. Delfs, E. Huang, W. Y. Hause, L. Garancis, J. Knoth, M. Amatruda, J. Bertino, J. Friesen, H. G. & Mattingly, R. F. The hormone-synthesizing trophoblastic cell in vitro: A model for cancer research and placental hormone synthesis. Ana. N. Y. Acad. Sci., 172:288-98, 1971. [ Links ]

Simpson, R. A. Mayhew, E. & Barnes, P. R. From 13 weeks to term, the trophoblast of human placenta grows by the continous recruitment of new proliferative units: A study of nuclear number using the Disector. Placenta, 13:501-12, 1992. [ Links ]

Soranzo, D. C. Della Torre, G. & Ingrosso, A. Formation growth and morphology of multicellular tumor spheroids from human colon carcinoma cell line (LoVo). Tumori., 72:459-67, 1986. [ Links ]

Sterio, D. C. The unbiased estimation of the number and sizes of arbitrary particles using the disector. J. Microsc., 134:127-36, 1984. [ Links ]

Warren, M. A. & Bedi, K. S. A quantitative assessment of the development of synapses and neurons in visual cortex of control and undernourished rats. J. Comp. Neurol., 227:104-8, 1984. [ Links ]

Warren, M. A. Simple morphometry of the nervous system. In: Quantitative methods in neuroanatomy. Stewart, M. G. (Ed). England, Chichester, 1992. pp.211-47. [& # 160Links & # 160]

Waseem, N. & Lane, D. P. Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci., 96:121-9, 1990. [ Links ]

Weibel, E. R. Stereological Methods. New York, Academic Press, 1979. [ Links ]

West, M. J. & Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the number of neurons in the human hippocampus. J. Comp. Neurol., 296:1-22, 1990. [ Links ]

White, T. E. Saltzman, R. A. Di Sant'Agnese, P. A. Keng, P. C. Sutherland, R. M. & Miller, R. K. Human choriocarcinoma (Jar) cells grown as multicellular spheroids. Placenta, 9(6):583-98, 1988. [ Links ]

Weibe, B. M. & Laursen, H. Human lung volume, alveolar surface area, and capillary length. Microsc. Res. Tech., 32(3):255-62, 1995. [ Links ]

Williams, M. A. Quantitative methods in biology. In: Practical Methods in Electron Microscopy. Glauert, A. M. (Ed.). Amsterdam, North-Holland, 1977. [ Links ]

Yuhas, J. M. & Li, A. P. Growth fraction as the major determinant of multicellular tumor spheroid growth rates. Cancer Res., 38:1528-32, 1978. [ Links ]

Dr. Chrissie Stansie Abaidoo
Department of Anatomy
School of Medical Sciences
Kwame Nkrumah University of Science and Technology
Kumasi
GHANA

Received: 01-06-2010
Accepted: 23-09-2010

/> Todo o conteúdo deste periódico, exceto onde está identificado, está licenciado sob uma Licença Creative Commons



Comentarios:

  1. Riston

    admirablemente!

  2. Fauktilar

    Qué palabras ... super, una frase notable

  3. Sneferu

    Siento mucho no poder ayudarte en nada. Espero que te ayuden aquí.



Escribe un mensaje