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5.4: Proteínas - Biología

5.4: Proteínas - Biología


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Proteinas

Las proteínas son moléculas complejas a menudo con una estructura tridimensional. Las proteínas forman componentes estructurales de las células, insulina, hemoglobina, músculo, enzimas,
ojos, color de cabello y miles de otros componentes corporales esenciales. En presencia de enlaces peptídicos, el reactivo de Biuret cambia de azul a violeta.

Prueba de Biuret para Protiens

Materiales

  • Tubos de ensayo
  • Gradillas para tubos de ensayo
  • Lápiz de cera
  • Reactivo de biuret

Hipótesis

Haga una hipótesis sobre qué sustancia (s) producirá un cambio de color con la prueba de Biuret

Procedimiento

  1. Etiquete los tubos de ensayo 1 - 6.
  2. Dibuja una línea a 1 cm del fondo de cada tubo de ensayo y otra línea a 2 cm del fondo de cada tubo.
  3. Complete la Tabla 3 para especificar qué tubo recibirá qué solución de prueba.
  4. Agregue la solución de prueba adecuada al nivel de la línea de 1 cm.
  5. Agregue reactivo de Biuret a la línea de 2 cm de cada tubo. Mezclar suavemente.
  6. Registrar datos en la tabla
TuboContenidoColor finalCompruebe si hay proteína presente
1Agua destilada
2Jugo de papa
3Glucosa
4Leche
5Clara de huevo
6Desconocido

De la boca al estómago

A menos que lo coma crudo, el primer paso en la digestión del huevo (o cualquier otro alimento con proteínas) consiste en masticarlo. Los dientes inician la descomposición mecánica de los grandes trozos de huevo en trozos más pequeños que se pueden tragar. Las glándulas salivales proporcionan algo de saliva para ayudar a tragar y al paso del huevo parcialmente triturado a través del esófago. Los trozos de huevo triturados ingresan al estómago a través del esfínter esofágico. El estómago libera jugos gástricos que contienen ácido clorhídrico y la enzima pepsina, que inician la descomposición de la proteína. La acidez del estómago facilita el despliegue de las proteínas que aún retienen parte de su estructura tridimensional después de la cocción y ayuda a descomponer los agregados proteicos formados durante la cocción. La pepsina, que es secretada por las células que recubren el estómago, desmantela las cadenas de proteínas en fragmentos cada vez más pequeños. Las proteínas del huevo son moléculas globulares grandes y su descomposición química requiere tiempo y mezcla. Las poderosas contracciones mecánicas del estómago agitan la proteína parcialmente digerida en una mezcla más uniforme llamada quimo. La digestión de proteínas en el estómago lleva más tiempo que la digestión de carbohidratos, pero menos que la digestión de grasas. Comer una comida rica en proteínas aumenta la cantidad de tiempo necesario para descomponer suficientemente la comida en el estómago. La comida permanece en el estómago por más tiempo, lo que hace que se sienta satisfecho por más tiempo.

Figura 5.4.2: La digestión de proteínas requiere las acciones químicas del jugo gástrico y las acciones mecánicas del estómago.


5.4: Proteínas - Biología

Las funciones de las proteínas
1. proteína es un polímero construido a partir de un conjunto de solo 20 tipos de monómeros llamados aminoácidos
2.Las proteínas son responsables de casi todo el funcionamiento diario de los organismos.
3.Las proteínas funcionales menos visibles circulan en la sangre y defienden el cuerpo de los organismos nocivos.
Aminoácidos
1. aminoácido El monómero consiste en un átomo de carbono central unido a cuatro socios.
2.tres de los socios del carbono central son iguales en todos los aminoácidos
3.cuatro socios: un átomo de hidrógeno, dos grupos carboxilo y un grupo amino
4.el grupo lateral de los aminoácidos atrae el agua
Construyendo una proteína
1.Las células crean proteínas uniendo los aminoácidos en una cadena llamada polipéptido
2.cada uno de los enlaces se crea mediante una reacción de deshidratación entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo carboxilo del siguiente aminoácido en la cadena
3.la mayoría de las cadenas polipeptídicas tienen al menos 100 aminoácidos de longitud
Forma de proteína
1.una proteína en forma simple de aminoácidos unidos entre sí no puede funcionar correctamente
2.La forma de una proteína también está influenciada por el entorno circundante.
3.Un cambio desfavorable en la temperatura, el pH o alguna otra calidad del medio ambiente puede hacer que una proteína se deshaga y pierda su forma normal.


Verificación de conceptos:
1. Dé al menos dos ejemplos de proteínas que pueda "ver" en el mundo que lo rodea. Cuales son sus funciones?
Cabello y músculos humanos. El cabello y los músculos de los humanos proporcionan almacenamiento de nutrientes a largo plazo.

2. Relacionar aminoácidos, polipéptidos y proteínas.
Los polipéptidos son cadenas unidas por aminoácidos y las proteínas son moléculas polipeptídicas.

3. Explica cómo el calor puede destruir una proteína.
El calor puede producir un cambio desfavorable de temperatura, por lo que el cambio puede hacer que una proteína se deshaga y pierda su forma normal.

4. ¿Qué partes de la estructura de un aminoácido son iguales en todos los aminoácidos? ¿Qué parte es única?
Todos los aminoácidos consisten en un carbono central unido a un grupo amino, un grupo carboxilo y un átomo de hidrógeno. Los grupos laterales.


Determinación de estructura

Actualmente existen varios enfoques para determinar la estructura de las proteínas de membrana, en particular la cristalografía de rayos X, la cristalografía electrónica y la espectroscopia de RMN. Dada su historia de éxito demostrado, la cristalografía de rayos X se considera la herramienta más probada para los esfuerzos de determinación de estructuras. Pero las características de la proteína diana, como el peso molecular, la solubilidad y la capacidad de cristalización, pueden dictar que otras metodologías sean más adecuadas para un producto génico en particular. Por ejemplo, pequeñas proteínas de membrana solubilizadas con detergente o péptidos con una gran proporción de superficie hidrófoba a volumen, que pueden no tener buenas propiedades de solubilidad a alta concentración, pueden ser excelentes candidatos para la espectroscopia de RMN.

Cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X proporciona un medio establecido para obtener datos estructurales de alta resolución a partir de proteínas de membrana. Con este enfoque, el peso molecular rara vez limita la elección de la proteína diana, y la determinación de estructuras a una resolución a nivel atómico es un objetivo muy realista. A menudo, la difracción de un monocristal es suficiente para la determinación de estructuras de alta resolución. En muchos casos, las dificultades que en el pasado estaban asociadas con la interpretación de las amplitudes de difracción de rayos X en términos de cómo reflejan la estructura cristalina subyacente, conocida como el 'problema de fase', se han reducido drásticamente mediante el uso de múltiples longitudes de onda anómalas. técnicas de difracción que se basan en el uso de rayos X de múltiples longitudes de onda y átomos de dispersión anómala proporcionados externamente que producen puntos de referencia dentro de la estructura cristalina [24]. Por ejemplo, las fuentes de rayos X de sincrotrón sintonizable facilitan la rápida puesta en fase de los datos de difracción obtenidos a partir de proteínas diana derivatizadas con selenometionina, preparadas mediante el marcaje metabólico de proteínas expresadas en E. coli. Las fuentes de rayos X de sincrotrón también permiten obtener conjuntos de datos de alta resolución a partir de microcristales [25], que a menudo no superan los 50 μm en su dimensión más larga, lo que reduce los posibles cuellos de botella asociados con la necesidad de optimizar las condiciones de cristalización en un esfuerzo por obtener cristales grandes. Se pueden obtener más ganancias en las tasas de rendimiento de las muestras mediante el cribado asistido por automatización de los pocillos de muestras para detectar la presencia de cristales, y el manejo automatizado de cristales y la recopilación de datos.

El principal desafío del enfoque de determinación de la estructura por difracción de rayos X radica en la obtención de cristales tridimensionales adecuados. Al igual que con las proteínas solubles, la homogeneidad y estabilidad de la proteína purificada a alta concentración es a menudo crítica para obtener cristales. Las estrategias para cristalizar proteínas de membrana se centran de manera similar en reducir la solubilidad de la proteína diana en condiciones que permitan el establecimiento de contactos formadores de cristales entre moléculas vecinas [26]. La solubilidad de las proteínas se reduce típicamente mediante el uso de agentes precipitantes, tales como sulfato de amonio y polietilenglicoles. Los parámetros experimentalmente variables que afectan el grado y la naturaleza del contacto molécula a molécula incluyen el pH, la fuerza iónica y la temperatura. Un factor exclusivo de la cristalización de proteínas de membrana es la presencia de concentraciones sustanciales de detergente necesarias para mantener la solubilidad de la proteína diana. Para asegurar la solubilidad de una proteína diana, la concentración de detergente debe mantenerse por encima de la concentración micelar crítica (CMC) que, dependiendo del detergente en cuestión, podría estar dentro del rango milimolar.

Como se mencionó anteriormente, un detergente que sea muy adecuado para la solubilización de proteínas puede no ser el detergente de elección para la cristalización, y los detergentes se pueden intercambiar mediante diálisis o durante la purificación mientras la proteína diana está unida a una columna cromatográfica. Al igual que con el cribado de detergentes para la optimización de la solubilización, se deben cribar una variedad de detergentes durante el transcurso de las pruebas de cristalización. Se ha utilizado una impresionante gama de detergentes para obtener cristales que producen difracción de alta resolución (Figura 2). Por consideraciones de empaquetamiento de cristales, los detergentes con el potencial de producir la región micelar más pequeña posible en la proteína solubilizada deberían apoyar mejor la formación de los contactos proteína a proteína necesarios para la cristalización. Una desventaja potencial es que los detergentes más pequeños tienden a tener CMC más altas, lo que requiere concentraciones más altas para mantener la solubilidad de las proteínas y es más probable que desestabilicen la estructura nativa. Por tanto, el objetivo debería ser identificar los detergentes más pequeños que mantengan soluciones homogéneas y monodispersas de proteínas diana estructuralmente sólidas. Alternativamente, el uso de detergentes secundarios o anfífilos como aditivos para alterar las propiedades de las micelas mixtas también ha producido cristales de alta calidad [27, 28]. La ubicación, o la mera presencia, de una etiqueta de afinidad puede desempeñar un papel en la determinación de si una proteína cristalizará, y puede ser aconsejable realizar ensayos de cristalización en proteínas diana en las que se han eliminado las etiquetas de afinidad de polihistidina. Los sitios de escisión diseñados en la proteína expresada pueden usarse para eliminar estas etiquetas usando una proteasa resistente a detergentes.

Detergentes primarios utilizados para la obtención de cristales de proteínas de membrana aptos para estudios estructurales de alta resolución [1]. Se indica la proporción de proteínas resueltas con cada detergente. Abreviaturas: OG, n-octil-β-D-glucopiranósido NG, n-nonil-β-D-glucopiranósido OM, n-octil-β-D-maltopiranósido DM, n-decil-β-D-maltopiranósido UDM, n- undecil-β-D-maltopiranósido DDM, n-dodecil-β-D-maltopiranósido TDM, n-tridecil-β-D-maltopiranósido C8E4, polioxietileno (4) octil éter C12E8, polioxietileno (8) dodecil éter C12E9 (9) polioxietileno ) dodecil éter C10DAO, n-decil-N, N-dimetilamina-N-óxido LDAO, n-dodecil-N, N-dimetilamina-N-óxido LAPAO, 3-laurilamido-N, N-dimetilpropilaminóxido FC14, n-tetradecilfosfocolina MEGA10 , decanoil-N-metilglucamida DHPC, 1,2-diheptanoil-sn-glicero-3-fosfocolina.

Las proteínas de membrana se han cristalizado mediante difusión de vapor (en la que se dejan equilibrar gotas colgantes y asentadas de una solución que contiene la proteína diana con una solución de depósito que contiene una mayor concentración de precipitante), y con menos frecuencia mediante diálisis y métodos por lotes (donde la proteína, el precipitante y el tampón se mezclan hasta alcanzar las concentraciones finales requeridas para la cristalización o muy cerca de ellas). Las pantallas de matriz dispersa (conjuntos relativamente pequeños de condiciones de cristalización que examinan una amplia gama de espacio de parámetros en intervalos gruesos) permiten un muestreo rápido de un rango diverso de precipitantes, condiciones de pH y fuerza iónica [29-31] que se han aplicado con éxito y son uniformes. disponible comercialmente (ver, por ejemplo, [32]). Estos métodos de cristalización y cribado se prestan bien a la automatización basada en robótica de alto rendimiento [33, 34]. Los dispositivos de microfluidos desarrollados recientemente también pueden ayudar a la rápida configuración y evaluación de pantallas de cristalización extensivas utilizando cantidades extremadamente pequeñas de muestra [35]. Por ejemplo, en un sistema disponible comercialmente es posible estudiar hasta 144 condiciones de un total de 3 µl de muestra [36, 37]. Este método mezcla reactivo y muestra a través del proceso de difusión de interfaz libre, mediante el cual la proteína y el reactivo pueden moverse libremente por todo el sistema y pueden permitir nuevos estudios de alto rendimiento del espacio de cristalización.

También se han desarrollado técnicas que se dirigen directamente a las preocupaciones únicas de la cristalización de proteínas de membrana, que incluyen métodos que implican el uso de fases cúbicas lipídicas [38] y bicelas [39]. El fundamento de estos métodos es la noción de que volver a colocar la proteína solubilizada en un entorno similar al nativo mejorará las posibilidades de cristalización. Ambos enfoques implican la cristalización de la proteína de membrana dentro del contexto de las bicapas lipídicas y se han utilizado para producir cristales bien ordenados de rodopsinas bacterianas, pero queda por determinar en qué medida se aplicarán los mismos enfoques a otras familias de proteínas de membrana.

Espectroscopia de RMN

Varias tecnologías de RMN diferentes utilizan una amplia variedad de entornos miméticos de membrana. La RMN en solución requiere movimientos isotrópicos de la proteína y, por lo tanto, las proteínas de la membrana deben solubilizarse dentro de las micelas de detergente. En muestras monodispersas homogéneas, las proteínas de membrana normalmente mantienen no solo su estructura secundaria y terciaria, sino también su estructura cuaternaria dentro de las micelas. En la RMN de estado sólido, las proteínas de membrana se pueden caracterizar en bicapas planas alineadas mediante el uso de restricciones de orientación que relacionan cada sitio atómico de la proteína con un eje de referencia perpendicular al plano de la bicapa lipídica. La RMN de estado sólido también se puede usar con muestras que no están uniformemente alineadas, como los liposomas multilaminares, usando restricciones de distancia y torsión que, respectivamente, restringen la estructura por distancias interatómicas o definen la orientación relativa de grupos atómicos adyacentes. Además, puede ser posible caracterizar la estructura de la proteína de membrana mediante RMN de estado sólido usando micro y nanocristales de proteínas de membrana nuevamente a través de restricciones de torsión y distancia. Si bien la RMN no requiere la cristalización de proteínas de membrana con calidad de difracción, la preparación de la muestra sigue siendo un cuello de botella, ya sea en la etapa de solubilización con detergente de la proteína a alta concentración, la reconstitución de la proteína en liposomas o la alineación uniforme de muestras bicapa .

Solución La metodología de RMN ha avanzado con nuevos procedimientos, como la espectroscopia optimizada de relajación transversal (TROSY), que ayudan en la recopilación de datos de muestras que caen lentamente en la escala de frecuencia de RMN (500 a 900 MHz). Los espectros de RMN de proteínas requieren el uso de marcaje isotópico de 15 N y 13 C para lograr sensibilidad y resolución en los espectros. La colección de restricciones estructurales que utilizan esta metodología es principalmente de acoplamientos dipolares residuales (RDC) que se derivan de muestras que tienen un ligero grado de alineación con respecto al campo magnético y a las distancias entre protones derivadas del efecto Overhauser nuclear (NOE) de las muestras. que están ampliamente deuterados [40]. Se requiere tal deuteración para mejorar la resolución en espectros de 1 H. Recientemente se han logrado excelentes avances en el desarrollo de la alineación parcial de estas proteínas mediante el uso de geles de poliacriamida estirados que generan un entorno anisotrópico para la proteína [41]. En otras palabras, la proteína en estos geles tiene una ligera preferencia por una orientación sobre otras posibles orientaciones. Para las hélices α, se observa un patrón con 3.6 resonancias por ciclo, en un fenómeno conocido como onda dipolar [42]. Debido a que las hélices α tienen 3.6 residuos por vuelta alrededor del eje helicoidal, se observa un patrón en las RDC de las resonancias de la amida del esqueleto 15 N con la misma periodicidad. La amplitud de las ondas representadas en los gráficos de RDC frente al número de residuos es característica del ángulo de inclinación de la hélice con respecto al eje de alineación y el eje del campo magnético. El éxito reciente de este enfoque ha dado lugar a la presentación de estructuras al AP [43] y el progreso con las proteínas oligoméricas politópicas está progresando en laboratorios adicionales (ver [44], por ejemplo).

En la RMN de estado sólido se utilizan dos tecnologías [45], una que requiere muestras de bicapa planas alineadas y la otra que utiliza muestras de giro de ángulo mágico (MAS), en las que las muestras de liposomas o microcristales o nanocristales se giran alrededor de un eje inclinado en 54,7 ° con respecto al campo magnético. De esta manera se eliminan las propiedades anisotrópicas de los espectros y se observa un espectro similar a una solución. Las bicapas uniformemente alineadas producen observables anisotrópicos, como acoplamientos dipolares y cuadrupolares, así como cambios químicos anisotrópicos. En otras palabras, estas interacciones de espín de RMN muestran una dependencia de la orientación con respecto al eje del campo magnético del espectrómetro de RMN. De esta forma, los acoplamientos y desplazamientos químicos observados pueden relacionarse con la orientación de los sitios atómicos con respecto a la normal bicapa, que se alinea paralelamente al campo magnético. En cuanto a las ondas dipolares descritas anteriormente, los espectros de muestras alineadas uniformemente en las que la interacción dipolar 15 N-1 H se correlaciona con el desplazamiento químico de 15 N, dan como resultado patrones circulares de resonancias para segmentos helicoidales α con 3.6 resonancias por vuelta, que recuerda a las ruedas helicoidales. Aquí los patrones, conocidos como ruedas PISA [46, 47], representan una oportunidad para evaluar los ángulos de inclinación de la hélice y las orientaciones sin la necesidad de, o con asignaciones de resonancia mínimas, respectivamente. Esta metodología representa una excelente herramienta de detección de información estructural de baja resolución. La sensibilidad y la resolución espectrales se han mejorado drásticamente en la última década, de modo que ahora son posibles las estructuras de la columna vertebral de proteínas pequeñas y se han demostrado estructuras completas de péptidos. Los experimentos MAS conducen a restricciones de torsión y distancia que son altamente complementarias a las restricciones de orientación. La resolución se mejora drásticamente en los experimentos MAS mediante el uso de muestras cristalinas en las que la conformación y el entorno de cada proteína son casi idénticos.

Si bien la primera estructura de RMN de estado sólido se depositó en el PDB en 1997, desde entonces se han depositado otras nueve estructuras en el banco de datos, y estas nueve se determinaron utilizando muestras alineadas uniformemente o muestras MAS. Además, las estructuras de tres proteínas de membrana de barril β se han resuelto mediante RMN en solución.

Cristalografía electrónica

Los cristales bidimensionales, que son cristales en forma de lámina de un grosor de celda unitaria, son ideales para los métodos de determinación de estructuras cristalográficas de electrones. Las proteínas de membrana cristalizadas en el contexto de las bicapas lipídicas representan un ejemplo excelente. Se han realizado numerosos estudios estructurales de cristalografía electrónica de proteínas de membrana utilizando tales muestras. No existe un "problema de fase" en la cristalografía electrónica como en la cristalografía de rayos X, ya que las micrografías electrónicas de muestras cristalinas producen imágenes a partir de las cuales se pueden determinar las fases directamente. Para producir un conjunto de datos estructurales que consta de amplitudes y fases de difracción, se recogen patrones de difracción de electrones (para obtener amplitudes más precisas) y micrografías de electrones (para obtener fases) de cristales bidimensionales inclinados y no inclinados. Estos datos se procesan posteriormente y se fusionan en conjuntos tridimensionales de factores de estructura. Los mapas de densidad tridimensionales de las moléculas diana obtenidos a partir de sus factores de estructura se modelan e interpretan de la misma manera que los mapas de densidad de electrones derivados de los datos de difracción de rayos X. Las recientes mejoras en la automatización del microscopio electrónico han dado lugar a un aumento de las tasas de recopilación de datos y a una reducción de los tiempos de procesamiento.

Los cristales bidimensionales naturales de bacteriorrodopsina (que se encuentran en la membrana violeta de las halobacterias) han producido los datos cristalográficos de electrones de una proteína de membrana de la mejor calidad hasta la fecha, lo que permite obtener un modelo a nivel atómico de esta proteína de membrana [48, 49]. . Se ha reconstituido un número sustancial de proteínas de membrana solubilizadas con detergente para formar cristales bidimensionales, algunos muy bien ordenados y de tamaño superior a 1 μm. Sin embargo, debido a los límites en la inclinación de la muestra, la distribución de resolución en los mapas de densidad producidos a partir de cristales bidimensionales es anisotrópica. La calidad de difracción, en la mejor dirección, del más útil de estos cristales ha oscilado entre aproximadamente 7 Å de resolución, que es suficiente para revelar la presencia de hélices transmembrana, hasta el rango de resolución de 4 a 3 Å, donde la cadena principal del polipéptido se puede modelar y asignar las cadenas laterales más grandes.

Se han desarrollado varias metodologías para obtener cristales bidimensionales a partir de proteínas de membrana solubilizadas, que incluyen la reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas y la cristalización a lo largo de monocapas lipídicas en interfaces aire-agua o en tubos lipídicos preformados [50]. El enfoque basado en la reconstitución de lípidos-bicapas es el único método que hasta la fecha ha producido datos estructurales de alta resolución. Los procedimientos de reconstitución implican mezclar la proteína diana solubilizada con detergente y el lípido en proporciones de lípido a proteína relativamente bajas, seguido de la eliminación o reducción de la concentración del detergente. Esto puede realizarse mediante diálisis, mediante adsorción de detergente en perlas de poliestireno o mediante dilución de la muestra. Tras la eliminación del detergente, las proteínas y los lípidos pueden asociarse para formar membranas con una alta densidad de proteínas en las condiciones adecuadas, que se organizan en matrices cristalinas. La formación y la calidad de los cristales resultantes dependen de parámetros como la elección de lípidos, concentración de proteínas, proporción de proteínas a lípidos, detergentes, tasas de eliminación de detergente, temperatura y otros factores, como el pH y la fuerza iónica que se encuentran a menudo. útil en la cristalización de proteínas en tres dimensiones. Al igual que con las otras técnicas de determinación de la estructura descritas anteriormente, la proteína de la membrana diana que se va a estudiar debe estar en un estado puro, homogéneo y estable. La concentración de proteína requerida para estos experimentos es, sin embargo, sustancialmente más baja que para los métodos de rayos X y RMN, en aproximadamente 1 mg / ml.


(1). Estructura primaria

Ø La estructura primaria de una proteína proporciona los detalles de la secuencia de aminoácidos de una proteína.

Ø La estructura primaria le dirá dos cosas principales: (i) los número de residuos de aminoácidos en la proteína y (ii) el secuencia de aminoácidos.

Ø La información de la "secuencia" contiene el orden correcto de aminoácidos en la proteína comenzando desde el N-terminal al C-terminal.

Ø La estructura primaria de una proteína determinará todos los demás niveles de organización estructural de una proteína (secundaria, terciaria y cuaternaria).

Ø La estructura primaria está estabilizada por Enlaces peptídicos (Enlace covalente).

Ø El primer estudio sobre una proteína desconocida será su determinación de secuencia (determinación de estructura primaria).

Ø Primera proteína secuenciada: Insulina por Frederick Sanger.

Estructura primaria de la insulina

Importancia de la estructura primaria:

Ø La estructura primaria de una proteína ofrecerá información sobre su:

(a). Tridimensional (3D) estructura

(B). Función de la proteína

(C). Celular localización

(D). Evolución de la proteína

Ø Los datos de la estructura primaria se pueden utilizar para la búsqueda de secuencia desde el bases de datos de proteínas.

Estructuras tridimensionales de proteínas

Ø La columna vertebral de una proteína contiene cientos de cautiverio.

Ø La rotación libre es posible alrededor de muchos de estos enlaces.

Ø La rotación libre permite un número ilimitado de conformaciones alrededor de estos enlaces.

Ø Sin embargo, cada proteína tiene un específico (único) conformación estructural.

Ø Esta formación estructural única de una proteína se llama su Estructura 3D.

Ø La disposición espacial de los átomos en una proteína se llama su "Conformación’.

Ø Las proteínas en sus conformaciones funcionales plegadas se denominan proteínas nativas.

Ø Las conformaciones de una proteína se estabilizan principalmente por interacciones débiles como enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofílicas, interacciones hidrofóbicas, etc.

Ø Estas interacciones débiles se pueden distorsionar fácilmente con un menor gasto de energía.

Ø Las proteínas pueden tener tres niveles de organizaciones tridimensionales (3D). Son:

Estructura secundaria

Estructura terciaria

Estructura cuaternaria

(2). Estructura secundaria

Ø La estructura secundaria es la conformación local especial de alguna parte de una cadena polipeptídica.

Ø Es el patrón de plegado de la columna vertebral del polipéptido regular.

Ø En la naturaleza ocurren diferentes tipos de estructuras secundarias.

Ø Las estructuras secundarias están estabilizadas principalmente por Enlaces de hidrógeno.

Ø Las tres estructuras secundarias más importantes de la proteína son:

B. Conformaciones β (placas β)

(A). α-Hélice

Ø La α-hélice es la estructura secundaria más común.

Ø Son estructuras regulares que repiten cada 5,4 Å.

Ø Es la disposición más simple de una cadena polipeptídica.

Ø La estructura α-helicoidal de la proteína fue propuesta por Pauling y Corey en 1951.

Ø El esqueleto polipeptídico se enrolla firmemente alrededor de un eje imaginario dibujado longitudinalmente a través del centro de la hélice, y los grupos R de los residuos de aminoácidos sobresalen hacia afuera del esqueleto helicoidal.

Ø Paso de hélice: La unidad repetitiva de la hélice.

Ø El paso es una sola vuelta de la hélice que se extiende sobre 5,4 Å.

Ø Cada giro helicoidal en α-helix contiene 3,6 aminoácidos.

Ø El giro helicoidal de la α-hélice en todas las proteínas es diestro.

Ø La hélice α está estabilizada por enlaces de hidrógeno.

Ø La α-hélice es tan común en las proteínas porque hace un uso óptimo de los enlaces de hidrógeno internos.

Ø Los enlaces de hidrógeno se forman entre el hidrógeno unido al átomo de nitrógeno electronegativo del enlace peptídico y el átomo de oxígeno del carbonilo electronegativo del cuarto aminoácido en el lado amino-terminal del enlace peptídico.

Ø Dentro de la α-hélice, cada enlace peptídico participa en el enlace de hidrógeno.

Ø Todos los enlaces de hidrógeno juntos proporcionan una estabilidad considerable a la hélice α.

Ø Todos los polipéptidos no pueden formar una hélice α sable.

Ø Las interacciones entre las cadenas laterales de aminoácidos pueden estabilizar o desestabilizar la α-hélice.

Ø Por ejemplo, si una cadena polipeptídica tiene un tramo largo de residuos de ácido glutámico, este segmento de la cadena no formará una hélice α.

Ø El grupo carboxilo cargado negativamente de los residuos de Glu adyacentes se repele fuertemente entre sí para evitar la formación de la α-hélice.

Ø Del mismo modo, un polipéptido rico en Prolina no formará una hélice α.

Ø En prolina, el átomo de nitrógeno es parte de un anillo rígido y rota alrededor del N - Cα la vinculación NO es posible.

Ø Así, la prolina introduce un desestabilizador pliegue en el polipéptido y, por tanto, la prolina se encuentra muy raramente en la hélice α.

Conformaciones β (placas β)

Ø La conformación β o placas β organizan las cadenas polipeptídicas en hojas.

Ø La conformación β es una extendido forma de una cadena polipeptídica.

Ø Aquí la columna vertebral del polipéptido se extiende en una zigzag estructura.

Ø Las cadenas polipeptídicas en zigzag se pueden colocar una al lado de la otra para formar una estructura que se asemeja a una serie de pliegues llamados láminas β.

Ø Aquí también la estructura es estabilizada por enlaces de hidrógeno.

Ø Sin embargo, a diferencia de la α-hélice, los enlaces de hidrógeno se forman entre segmentos adyacentes de la cadena.

Ø Los grupos R de aminoácidos adyacentes sobresalen de la estructura en zigzag en dirección opuesta creando el patrón alterno.

Ø Las cadenas polipeptídicas en las hojas β pueden disponerse en paralelo (la misma dirección) o antiparalelo (dirección opuesta).

Ø En base a esto, las placas β se clasifican en dos tipos: (diagrama)

(a) Placas β antiparalelas

(b) Placas β paralelas

Ø Los giros β son muy comunes en las proteínas, donde el péptido hace un giro o bucle (el péptido hace una dirección inversa).

Ø En las proteínas globulares, casi un tercio de los residuos de aminoácidos se encuentran en giros β.

Ø Los giros β son los elementos de conexión que enlazan sucesivas cadenas polipeptídicas.

Ø El giro β conecta los extremos de dos segmentos adyacentes de láminas β antiparalelas.

Ø La estructura β-turn es una Giro de 180º que implica cuatro residuos de aminoácidos

Ø El oxígeno carbonilo del primer residuo forma un enlace de hidrógeno con el grupo amino hidrógeno del cuarto aminoácido a su vez.

Ø La glicina (Gly) y la prolina (Pro) residen con frecuencia en los giros β.

Ø La glicina por su tamaño muy pequeño (el grupo R es - H) permite giros β.

Ø La prolina es un iminoácido con su cadena lateral unida covalentemente con el grupo amino.

Ø El residuo de prolina en el enlace peptídico asume el "Cis" configuración.

Ø El "Cis" La conformación es muy adecuada para giros cerrados.

Ø Hay varios tipos de giros β de tipo I y el tipo II son los más comunes.

Ø El giro β tipo I se encuentra con más del doble de frecuencia que el tipo II.

Ø En el tipo II, el tercer residuo siempre será un residuo de glicina.

(3). Proteínas de estructura terciaria

Ø Estructura terciaria: La disposición tridimensional general de todos los átomos de una proteína se denomina estructura terciaria.

Ø La estructura terciaria tendrá un único polipéptido & # 8220 troncal & # 8221 con una o más estructuras secundarias.

Ø La estructura terciaria está definida por coordenadas atómicas.

Ø Las estructuras terciarias de una proteína se estabilizan mediante enlaces covalentes y no covalentes.

Ø Enlace covalente: Enlaces disulfuro (entre dos residuos de Cys)

Ø Interacciones no covalentes: interacciones iónicas (atracciones electrostáticas), interacciones hidrofílicas, interacciones de van der Waals.

Ø El término "Dominio’Se utiliza para denotar una sola unidad funcional de una proteína.

Ø Una proteína puede tener muchos dominios con funciones específicas.

Ø Una proteína con una sola subunidad solo tiene hasta la estructura terciaria.

(4). Estructura cuaternaria

Ø La mayoría de la proteína funcional contiene más de una cadena polipeptídica y se dice que dicha proteína es oligomérico.

Ø Cada péptido forma un subunidad o monómero o protómero.

Ø Estructura cuaternaria: La disposición de los monómeros de proteínas en complejos tridimensionales en una proteína de múltiples subunidades se denomina estructura cuaternaria.

Ø Para que una proteína tenga una estructura cuaternaria, debe cumplir dos condiciones:

§ Debe tener más de una subunidad polipeptídica

§ No debe haber interacción permanente (covalente) entre las subunidades (como un enlace disulfuro).

Ø La insulina no tiene la estructura cuaternaria incluso si contiene dos subunidades.

Ø Los dos polipéptidos de la insulina están conectados covalentemente con dos enlaces disulfuro.

Ø Así, la insulina puede tener una estructura hasta terciaria (no estructura cuaternaria).

Ø Enlaces estabilizadores de estructura cuaternaria: enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofílicas, interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals.

Nelson, D.L., Lehninger, A.L. y Cox, M.M., 2008. Lehninger & # 8217s Principles of Biochemistry. Macmillan.

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En silico veritas?

En una serie de tres publicaciones recientes [9-11], Steve Brenner y sus colegas sugirieron, mediante la extracción de datos, que un tercio de los productos de empalme humano inferidos de manera confiable forman una clase importante de objetivos naturales para la ENM. Se cree que el empalme alternativo ocurre en el 30-60% de los genes humanos, expandiendo el repertorio de codificación del número limitado de genes en el genoma y modulando las funciones génicas específicas del tejido y del desarrollo. Brenner and colleagues [9–11] now suggest that alternative splicing provides a mechanism to generate PTC-containing splice products that are subsequently degraded by NMD and, as a consequence, that cooperation between alternative splicing and NMD pathways offers a major and currently underappreciated way to regulate gene expression.

For their en silico analysis, they mapped well-characterized human RefSeq [16] and LocusLink [17] mRNA sequences to genomic sequences, and then performed high-stringency alignments between these 'RefSeq-coding genes' and expressed sequence tags (ESTs). The reliably inferred splice variants were only accepted as likely NMD targets when they conformed to the '50-nucleotide rule': this hallmark of mammalian NMD predicates that stop codons located at least 50 nucleotides upstream of the last exon junction will be interpreted as 'premature' and trigger NMD. This approach leads to an underestimate of potential NMD targets, because some PTCs (for example, in T-cell receptor gene transcripts) will trigger NMD even when they are not followed by a sufficiently distant intron [18]. Moreover, Brenner and colleagues [9–11] also excluded mRNA variants that are indistinguishable from products of faulty splicing. These studies have unearthed several groups of functionally related proteins whose expression appears to be regulated by NMD, including translation factors and ribosomal proteins. This is in remarkable contrast to the yeast data of He et al. [8], where proteins with a function in translation were, if anything, underrepresented in the pool of NMD-regulated genes.

NMD is not (yet) on everyone's mind. As a consequence, Brenner and colleagues [11] found several entries for truncated proteins in the Swiss-Prot database. In some of these cases the available experimental evidence confirms that the mRNAs that encode these truncated proteins are De buena fe NMD substrates. We are left with a consolation and a surprise. The consolation is that traces of NMD can be uncovered even though they had been overlooked before. Having recently had to accept that the number of genes in the human genome is too limited to explain the far higher number of proteins (not to mention other gene products), we then had to learn that one plausible and elegant explanation lies in alternative splicing, which enables a gene to code for a whole family of related, or sometimes antagonistic, proteins. And now the surprise is that a large portion of this effort is supposedly expended only to direct many of the primary products to decay. Several conclusions can be drawn from these observations. First, databases need to be read and annotated with a full realization of the implications of NMD and second, NMD seems to serve as a tool for rapidly switching off gene expression. This view extends the idea of NMD as a mechanism for ridding the cell of the potentially harmful products of faulty splicing. But there may be more to it. NMD rarely downregulates the expression of a transcript completely more commonly, 10-30% of the PTC-containing transcripts survive and may allow the production of physiologically relevant levels of truncated protein products.

For NMD researchers it has always been hard to reconcile these observations with the presumed protective role of NMD, especially as very low levels of biological products can sometimes have enormous effects. Given the problems of detecting the low levels of proteins or peptides produced from downregulated transcripts, in addition to some lingering lack of awareness of NMD, examples to prove otherwise are hard to come by. A recent publication [19] describes a PTC-containing transcript of the high-affinity immunoglobulin E (IgE) receptor, FcεRIβ, arising from retention of an intron. This alternative transcript not only conforms to the 50-nucleotide rule but its expression levels are very low compared to those of the full-length transcript, as would be expected for an NMD target. Nonetheless, the truncated protein is not only detectable, it even competes effectively with the full-length protein to control FcεRIβ expression on the cell surface. Thus, even low endogenous expression levels of NMD targets can suffice to generate a product with a biological function. A similar example of the utility of a De buena fe NMD substrate is illustrated by the unc-49 locus in C. elegans. This locus uses alternative splicing to produce three GABA-receptor subunits, two of which (A and B) undergo several splice events in their 3' UTRs, rendering them predicted NMD substrates [20]. While A-form transcripts are hardly detectable, B-form transcripts represent the most abundant form and code for a protein essential for the worm's locomotion. Either the B-form transcript escapes NMD, or the residual mRNA left after NMD suffices for the necessary protein production.

Among the examples presented by Brenner and colleagues [11] or in other studies [21] are genes with complex alternative splice patterns resulting in multiple transcript isoforms with or without PTCs. The lower abundance of these isoforms when compared to the full-length form supports the notion that they are targeted to the NMD pathway. But is the possibility that cells engage in complex alternative-splicing procedures generating multiple products, just to finally dispose of them, the only conceivable option? Four out of five PTC-containing isoforms of the mRNA for the LARD death receptor are readily detectable in non-activated lymphocytes, whereas only the full-length form is expressed in activated lymphocytes [11]. While it is entirely possible that the PTC-containing forms are generated to switch off receptor expression in resting lymphocytes, there are attractive alternatives: as in the case of the FcεRIβ receptor [19], the PTC-containing mRNAs may produce proteins or peptides with relevant, although currently unknown, functions. Thus, quantitative control of the expression of low amounts of protein isoforms could represent yet another facet of the function of the NMD pathway.

A role for NMD in controlling the levels of noncoding RNAs (including noncoding alternative splice products) must also be considered. RNA accounts for more than 95% of the human genome's output and there is increasing evidence that noncoding RNAs (including introns, and spliced and polyadenylated transcripts) can have a function, for example as a modulating network or an additional layer of information [22, 23]. Importantly, noncoding RNAs have been discovered among natural NMD targets in yeast [8], where only a relatively small portion of the genome is transcribed into noncoding RNAs. What might be the role of NMD in mammals, which transcribe a far higher percentage of their genome into noncoding RNAs [22, 24, 25]? Clearly, the recent insights into the RNA-substrate spectrum of the NMD system should enhance the appreciation of NMD as a versatile, multipurpose mechanism that controls the transcriptome qualitatively and quantitatively.


5.4: Proteins - Biology

1. Amino acids are linked together by condensation to form polypeptides.

  • two amino acid monomers are linked to form a dipeptide
  • releasing one H2O molecule
  • repeated condensation synthesis reactions produce polypeptides (=proteins)

3. Amino acids can be linked together in any sequence giving a huge range of possible polypeptides.

number of amino acids number of possible different combinations in a single polypeptide
1 20
2 400
3 8000
4 160000
300 (a typical protein) 20 300 > number of atom in the universe!!

• Students should know that most organisms use the same 20 amino acids in the same genetic code although there are some exceptions. Specific examples could be used for illustration.

4. The amino acid sequence of polypeptides is coded for by genes.

5. A protein may consist of a single polypeptide or more than one polypeptide linked together.

6. The amino acid sequence determines the three-dimensional conformation of a protein.

  • sequence and number of amino acids
    • each position occupied by one of 20 amino acids
    • linked by peptide bonds
    • interactions between variable R- groups forming:
      • hydrophobic interactions between nonpolar amino acids
      • hydrogen bonds between polar amino acids
      • ionic bonds between ionic amino acids
      • covalent bonds between sulfur containing amino acids

      proteins can be made of more than one polypeptide linked together:

      • aggregations of polypeptides form interactions between:
        • more than one polypeptide
        • polypeptides + non-proteinaceous molecules, such as:
          • metals, e.g. iron in hemoglobin
          • vitamins as enzyme cofactors
          • nucleic acids as in ribosomes
          • carbohydrates in glycoproteins
          • lipids in lipoproteins

          • Application: Denaturation of proteins by heat or by deviation of pH from the optimum.

          7. Living organisms synthesize many different proteins with a wide range of functions.


          What is cell-free expression?

          Cell-free protein synthesis circumvents and simplifies protein production workflows. Although the technique is not new, recent improvements have made it more convenient, especially in high-throughput applications.

          In vitro protein expression requires two components (Figure 1). First, cellular extracts are required. These contain a specific blend of essential enzymes for RNA transcription and protein translation, amino acids, ribonucleotides, tRNA, co-factors, ATP, and buffers. These cellular lysates are available in user-friendly, master mix formulations [3]. Cellular lysates for in vitro protein transcription and translation are derived from prokaryotes such as E. coli, insect cells, or eukaryotic cells such as wheat germ or rabbit reticulocytes [2], which offer flexibility for modification types.

          The second component is a DNA template with a 5&rsquo untranslated region (UTR), promoter, other gene expression control elements, protein coding sequence, transcriptional terminator, and 3&rsquo UTR. The simplest method of creating the template DNA is to order a custom linear double-stranded DNA (dsDNA) gene fragment or gene, both available through Integrated DNA Technologies. The entire template can be synthesized as a single dsDNA fragment since the fragments are available in lengths up to 3000 bp. There is no need to manipulate the DNA with PCR, subcloning fragments, vector construction, or DNA extractions. Simply rehydrate your custom designed fragment, add to the master mix, incubate, and test the expressed protein without purification.


          & ltp> Esta sección proporciona información útil sobre la proteína, principalmente conocimientos biológicos. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Función i

          In the hair cortex, hair keratin intermediate filaments are embedded in an interfilamentous matrix, consisting of hair keratin-associated protein (KRTAP), which are essential for the formation of a rigid and resistant hair shaft through their extensive disulfide bond cross-linking with abundant cysteine residues of hair keratins. The matrix proteins include the high-sulfur and high-glycine-tyrosine keratins.


          Ver el vídeo: Del ADN a la PROTEÍNA (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Kakora

    ¡Así que esta es la historia!

  2. Yozshuzuru

    Está usted equivocado. Me ofrezco a discutirlo. Escríbeme en PM, hablamos.

  3. Abdulla

    We are waiting for the continuation :)

  4. Adlar

    ¿Y dónde nos detenemos?

  5. Napayshni

    Por supuesto que tienes razón. Hay algo en esto y me gusta esta idea, estoy completamente de acuerdo contigo.

  6. Abran

    Confía en mí.



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