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Extracción de ADN libre de células

Extracción de ADN libre de células


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¿Alguien ha tenido éxito en la extracción de ADN libre de células del plasma sin utilizar kits costosos? Ya he gastado gran parte de mi propia sangre tratando de utilizar métodos estándar de fenol / cloroformo con un rendimiento mínimo. Sé que es posible que, dado que no estoy embarazada y no tengo cáncer (espero), es posible que mi sangre no tenga una gran cantidad de ADN libre de células para empezar, pero tengo miedo de comenzar a usar valiosas muestras experimentales hasta que esté confiado en que tengo una técnica que funcionará.

Para algunos antecedentes, el ADN libre de células es el ADN que circula en el plasma (a diferencia de la mayoría del ADN que es celular). Esta se ha convertido en una nueva y emocionante forma de analizar el ADN fetal de la sangre de una madre sin hacer una amniocentesis peligrosa. También hay pruebas sólidas de que el ADN tumoral también se puede encontrar en abundancia de esta manera (la mayoría de los estudios parecen estar relacionados con el cáncer de próstata).

Qiagen tiene un kit a la venta para extraer este ADN, pero es bastante caro y todavía creo que el fenol / cloroformo me daría un rendimiento alto (aunque menos puro). Hay un artículo en Cancer Biomarkers 2013 de Mazurek et al que afirma que compara métodos y muestra un rendimiento razonable con este método, pero no lo he reproducido. ¿Alguien aquí ha tenido éxito y, de ser así, qué modificaciones utilizó? ¿Es el momento de pasar al uso de muestras que tienen más probabilidades de tener mayores cantidades de ADN libre de células?


Notar: No tengo experiencia personal con este protocolo. Estoy reenviando este documento, que me entregó un colega.

Hay muchos kits y métodos disponibles que no dependen de Qiagen. O, alternativamente, si les preguntas amablemente, hacen un gran descuento en su primer kit que les compras como una especie de prueba (ya que no hacen muestras).

Sin embargo, para responder a su pregunta principal, ¿está agregando un detergente y desnaturalizando con calor sus muestras primero antes de fenol-cloroformo (Triton / Heat / Phenol)?

Las muestras de sangre para el análisis de CFDNA se recogen en tubos con EDTA y se mantienen a / o por debajo de TA (18 ° C-22 ° C) durante no más de 2 h antes de la separación del plasma. El plasma debe separarse de las muestras de sangre total mediante doble centrifugación (800 gy 1600 g durante 10 min, por separado), evitando la lisis de leucocitos. Preferimos aislar CFDNA inmediatamente después de la separación del plasma para minimizar el efecto del almacenamiento prolongado. De lo contrario, las muestras deben dividirse en alícuotas en pequeñas porciones y almacenarse a -70 ° C antes de la extracción porque la fragmentación del CFDNA podría ser causada por ciclos repetidos de congelación-descongelación.

Para el método THP, se mezclaron 500 μl de plasma / suero con 5 μl de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se desnaturalizó por calor a 98 ° C durante 5 min. Las muestras se colocaron en hielo durante 5 min, luego se extrajeron con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25: 24: 1, v: v: v) (Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se centrifugaron durante 10 min a 14.000 g. . La fase acuosa se precipitó durante la noche con 1/10 de volumen de NaOAc 3 M y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a -20ºC. El sedimento de ADN se lavó con etanol, se secó al aire y se resuspendió en 50 µl de ddH2O.

En el protocolo THP, se utilizó la incubación a 98 ° C para inactivar los inhibidores de la PCR y desnaturalizar las proteínas en las muestras de plasma / suero. Se probaron diferentes tiempos y temperaturas antes de elegir esto. Dado que habíamos notado una contaminación sustancial de ADN en SDS, se utilizó Triton X-100 en el paso de solubilización de proteínas. La PCR convencional directa se realizó con éxito en muestras desnaturalizadas por calor y fue capaz de detectar 25 ng / ml de ADN, lo que indica que este sencillo procedimiento ofrecía suficiente digestión de proteínas y eliminación de inhibidores para el análisis de PCR. El protocolo THP dio un rendimiento significativamente mayor de solución de ADN puro para el análisis de qPCR que el kit QIAamp. El protocolo THP mostró una alta eficiencia incluso con pequeños fragmentos de ADN tan bajos como 100 pb.

Es posible que desee leer esto: Xue, Xiaoyan y col. "Optimización del rendimiento y la utilidad de la circulación de ADN libre de células de plasma y suero". Clínica Chimica Acta 404.2 (2009): 100-104.

Una búsqueda rápida en Google Scholar también reveló algunos otros artículos que podrían interesarle:

Fleischhacker, Michael y col. "Los métodos para el aislamiento de ADN plasmático libre de células afectan en gran medida el rendimiento del ADN". Clinica Chimica Acta 412.23 (2011): 2085-2088.

ACTUALIZAR:

Después de leer esto (Fong, Siew Lee y col. "Comparación de 7 métodos para extraer ADN libre de células de muestras de suero de pacientes con cáncer colorrectal". Química clínica 55.3 (2009): 587-589.) que da alrededor de 7 protocolos (lamentablemente sin ninguna referencia por alguna razón) fui a buscar y se me ocurrió esto:

El ADN se extrajo de 1,0 ml de plasma mediante el método de fenol-cloroformo con ligeras modificaciones. Se trató un ml de plasma con solución 1x SDS / Proteinasa K (0,5 mg / ml) (1: 1), se incubó durante la noche a 56 ° C seguido de tratamiento con fenol-cloroformo (4: 1) y se centrifugó a 7 000 rpm. La capa superior se transfirió a tubos de centrífuga nuevos de 15 ml y se repitió el mismo paso de nuevo; El ADN se precipitó añadiendo glucógeno (0,1 µg / µl), acetato de amonio (7,5 M) y alcohol absoluto. El sedimento de ADN se obtuvo centrifugando a 7 000 rpm; se lavó con alcohol al 70% a 10 000 rpm, se secó y finalmente se disolvió en tampón TE a 56 ° C y se almacenó a -20 ° C hasta su uso posterior.

Puede leer sobre el método anterior aquí: Singh, Deepika Misra1 Renu y Monisha Banerjee. "Un método simple y confiable para obtener ADN fetal de la circulación materna; su precisión y sensibilidad".

Además, si está disponible para usted, podría valer la pena:

Gahan, Peter B., ed. Ácidos nucleicos circulantes en el diagnóstico precoz, el pronóstico y la monitorización del tratamiento: una introducción. Vol. 5. Springer, 2014.


Extracción de ADN libre de células del plasma

  • Kit de ácido nucleico circulante QIAamp: el kit utilizado por muchos estudios de cfDNA.
  • Kit de ADN en suero ZR: el protocolo utiliza ZymoBeads pero con un tampón de lisis genómico, ¿posiblemente no sea una buena idea si esto lisa los glóbulos blancos que quedan en su muestra?
  • Enriquecimiento mediado por polímeros (PME) de AnalytikJena: para procesar hasta 5 ml de plasma en menos de 1 hora.
  • Norgen & # 8217s Plasma / Serum Cell-Free Circulating DNA Kit: procesamiento de columna de centrifugación de 10μL a 400μL de plasma o suero.
  • NucleoSpin plasma XS: procesamiento en columna de centrifugación de hasta 240 μl de plasma o suero.
  • Kit FitAmp de EpiGenTek: procesamiento de columna de centrifugado de plasma o suero utilizando su tampón de aislamiento de ADN patentado en 12 minutos.
  • Kit de NA circulante de Chemagen: procesamiento de procesamiento de columna de centrifugación de 1 a 4 ml de plasma o suero.

Un artículo de 2003 [1] propuso el uso de perlas magnéticas para la extracción de ADN libre de células y las comparó con la extracción de Qiagen. Ambos métodos dieron resultados reproduciblemente similares (volveré a esto al final de esta publicación).

Un artículo de 2009 del Hospital General de Singapur [2] comparó 7 métodos de extracción. Informaron características de rendimiento muy diferentes y su propio método de yoduro de sodio (protocolo disponible a pedido), un método de fenol / coloformo y los métodos Qiagen QIAamp fueron los de mejor rendimiento.

Barret et al 2011 [3] evaluaron diferentes tubos de recolección (tubos K (3) EDTA y STREK) y condiciones de almacenamiento sobre el rendimiento de cfDNA de sangre materna. Utilizaron PCR digital de ensayos de PCR cortos (cfDNA) y largos (ADNg materno) para demostrar que la proporción de cfDNA disminuye con el tiempo debido al aumento del ADN materno debido a la lisis celular, pero que esto "se puede prevenir en gran medida" mediante la recolección. en tubos STRECK. También demostraron que el almacenamiento a 4 ° C y # 176 ° C no es necesario, pero que la centrifugación inmediata después de la extracción de sangre es particularmente cuando las muestras no pueden procesarse inmediatamente.

Extracción de ADN sin células basada en perlas: Eliminar el paso de centrifugación haría que los protocolos fueran mucho más fáciles de usar, pero es probable que requiera protocolos de recolección, almacenamiento y procesamiento muy definidos para minimizar la contaminación del ADNg de los glóbulos blancos.

LGC publicó un artículo [6] que describe un método que comercializan para extraer ADNg de manchas de sangre secas. Esto comienza con un paso de lisis celular, por lo que no es adecuado para el ADN circulante, sin embargo, la unión a perlas magnéticas es un proceso tan fácil de ejecutar en el laboratorio que me pregunto si podríamos usarlo para una extracción directa basada en perlas de sangre completa ( u orina), sin centrifugación?

En las diapositivas 'Boot Camp' de Broad (una gran introducción a NGS de alrededor de 2010) presentan la siguiente figura de un SPRI doble para la selección de tamaño. Mi idea es modificar este principio para capturar todo el ADN en un tubo de sangre inmediatamente al cerrar la tapa con un reactivo que haría un cóctel SPRI de alta concentración (2.5x). Esto conduciría todos ADN en las perlas, incluido todo el ADN libre de células y de alto peso molecular de los glóbulos blancos. Luego, el tubo se colocaría en un imán que capturaría todo el ADN en solución y permitiría que todo lo demás, células, plasma, etc., se vierte. Después de un lavado rápido, el ADN libre de células se eluirá preferentemente con una mezcla de SPRI de baja concentración (0,5x), dejando el ADN de alto peso molecular unido a las perlas. La reformulación como parte de un tubo de recolección de sangre, similar a los tubos de recolección de saliva de DNA Genoteks, podría hacer que esta sea una muestra muy fácil de recolectar y procesar. Y es de esperar que la eliminación de cualquier paso de centrifugación y la capacidad de recolectar ADN libre de células de toda la muestra aumente la sensibilidad al maximizar la recuperación de ADN libre de células.


Enzimas marinas y metabolismo especializado - Parte B

Soo Y. Ro, Amy C. Rosenzweig, en Métodos en enzimología, 2018

6.1 Extracción de ADN de Sra. Trichosporium Células OB3b en placas de agar

Extracción de ADN de Sra. Trichosporium OB3b es menos eficiente que la extracción de ADN de muchas bacterias metanotróficas de Tipo I o Tipo II. Los métodos existentes utilizan el método de lisis neutra / CsCl o un DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen) para extracciones de ADN de cultivos líquidos (Gu et al., 2016 Smith & amp Murrell, 2011). Sin embargo, el cultivo de cultivos líquidos para genotipar colonias múltiples requiere mucho tiempo. En su lugar, se ha desarrollado un método mejorado para extraer ADN de células que crecen en placas de agar utilizando el kit de purificación de ADN completo MasterPure (Epicenter, Cat. No. MC85200). Este método permite un mayor rendimiento de detección de genotipos y proporciona mayores rendimientos de ADN a partir de cantidades más pequeñas de células. El protocolo del kit de purificación de ADN completo MasterPure se ha modificado para Sra. Trichosporium OB3b:

Agregue 20 μL de proteinasa K (NEB, 800 U / mL) en 300 μL 2 × solución de lisis celular y de tejido para cada muestra.

Arrastre un asa de inoculación estéril a través del cultivo en placa de agar hasta que el asa esté cubierta de células (Fig. 5).

Figura 5. Cantidad de Sra. Trichosporium Las células OB3b necesarias para la extracción de ADN se muestran en un asa de inoculación de 1 μL.

Agite el asa de inoculación en la solución de lisis y resuspenda completamente pipeteando.

Incubar la muestra a 65 ° C durante la noche a 500 rpm.

Agregue 5 μl de RNasa A (epicentro, 5 μg / μl). Incubar durante 1 ha 37 ° C sin agitar.

Coloque las muestras en hielo durante 5 min.

Agregue 150 μL de reactivo de precipitación de proteínas MPC y agite en el vórtex.

Centrifugue la muestra a 10,000 × gramo a 4 ° C durante 10 min para sedimentar los restos celulares.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue 500 μL de isopropanol al 100% en hielo. Invierta manualmente la muestra 30 veces.

Centrifugar la muestra a 4 ° C durante 30 min a 20.000 × gramo para sedimentar el ADN.

Lave el sedimento de ADN con 750 μl de etanol al 70% en hielo. Centrifugar a 20.000 × gramo a 4 ° C durante 5 min, retire el etanol y repita el paso de lavado una vez más.

Deje que el sedimento se seque a 37 ° C hasta que desaparezca el etanol residual.

Resuspender el sedimento con 50 l de tampón TE e incubar durante la noche a 4 ° C.

El rendimiento de ADN puede variar de 10 a 60 μg. Es posible que se requieran pasos de limpieza adicionales utilizando columnas de centrifugación de sílice (Zymo) para usos distintos a la secuenciación simple de Sanger.


Un nuevo método para mejorar la eficiencia de extracción y la pureza del ADN libre de células plasmáticas y de orina

Este estudio evaluó tres kits de extracción de ADN libre de células (cfDNA) disponibles comercialmente y el impacto de un procedimiento de limpieza de ADN basado en PEG (DNApure) en la calidad y el rendimiento de cfDNA. Seis muestras de orina y plasma de donantes normales y muestras de cuatro mujeres embarazadas (PG) con fetos masculinos se sometieron a extracciones con el kit de extracción JBS cfDNA (kit J), el kit MagMAX Cell-Free DNA Extraction (kit M) y el ácido nucleico circulante QIAamp Kit (kit Q). Recuperación de un producto de PCR con picos, endógeno TP53, y se utilizó ADN del cromosoma Y para evaluar el rendimiento del kit. Los perfiles de ADN de tamaño nucleosómico variaron entre los kits, con picos prominentes de tamaño multinucleosómico presentes en el ADN de la orina y el plasma aislados por los kits J y M únicamente. El kit J recuperó significativamente más ADN con picos en comparación con el kit M o Q (pag& lt0.001) de la orina y cantidades similares de plasma (pag= 0,12). La aplicación de DNApure al ADN aislado del kit M y Q mejoró significativamente la eficiencia de amplificación del ADN espinoso de la orina (pag& lt0.001) y plasma (pag≤0,013). Además, el kit J aisló significativamente más ADN del cromosoma Y de la orina PG en comparación con el kit Q (pag= 0,05). Llegamos a la conclusión de que DNApure proporciona un medio eficaz para mejorar el rendimiento y la pureza del cfDNA y minimizar los efectos de la variabilidad preanalítica de muestras biológicas en el rendimiento del ensayo de biopsia líquida.

Declaración de intereses en competencia

Selena Lin, Matthew Marshall y Barbara Johnson son empleados de JBS Science, Inc. Selena Lin es accionista de JBS Science, Inc. Ying-Hsiu Su ha recibido financiación de JBS Science, Inc. Todos los demás autores no tienen conflictos con declarar.


Si la fragmentómica de cfDNA tiene el potencial de traducirse en aplicaciones clínicas, ¿cuál es la aplicación más probable que surja primero?

Florent Mouliere: Más que una aplicación clínica específica, la fragmentómica de cfDNA podría combinarse primero con otras "ómicas" para aumentar su potencial para analizar cfDNA. Los fragmentos de cfDNA de una variedad de células y tejidos tienden a ser más cortos que el cfDNA derivado de células hematopoyéticas en ~ 25 pb. Esto se ha demostrado en cfDNA derivado de placenta en el embarazo, cfDNA derivado de trasplante y cfDNA derivado de tumor. Este pequeño cambio ya ha permitido nuevas estrategias analíticas. Por ejemplo, al seleccionar fragmentos cortos mediante métodos in vitro e in silico, podemos observar un enriquecimiento relativo de una señal celular específica (por ejemplo, señal tumoral en el plasma de un paciente con cáncer). Para la biopsia líquida, filtrar el ruido biológico vinculado a la hematopoyesis clonal de potencial indeterminable enriquecido en rangos de tamaño específicos mejora la llamada de mutación cuando la fracción tumoral es baja (y por lo tanto reduce la señal de falso positivo). Curiosamente, como estos enfoques se basan en la propiedad intrínseca de la fragmentación de cfDNA, podrían implementarse independientemente de la tecnología utilizada (por ejemplo, secuenciación dirigida o captura híbrida).

Dennis Lo: Creo que muchos aspectos de la fragmentación de cfDNA están relacionados con el tejido de origen de las moléculas de cfDNA en cuestión. Por ejemplo, las tasas y los tipos de muerte celular son diferentes para diferentes tejidos. Además, los principales actores de la fragmentación del ADNc (por ejemplo, los tipos y concentraciones de nucleasas, la estructura de la cromatina, las moléculas que se unirían a los factores de transcripción del ADN) también variarían de un tejido a otro. Desde el punto de vista diagnóstico, la capacidad de discernir el tejido de origen sería muy valiosa en la detección de cáncer (para la localización del cáncer y la detección de metástasis), pruebas prenatales no invasivas (donde el ADN 'fetal' proviene principalmente de la placenta), postrasplante seguimiento (para detectar ADN procedente del órgano trasplantado).

Ellen Heitzer: El beneficio de incluir la presencia de fragmentos de ADN derivados de la placenta más cortos para establecer la fracción de ADN fetal en las pruebas prenatales no invasivas (NIPT) ya está bien documentado. Dado que existe una creciente evidencia de muchas aplicaciones de cfDNA en pacientes con cáncer de que la precisión y la resolución pueden incrementarse si los análisis se limitan a fragmentos de ADN bastante más cortos, la inclusión de dicha información basada en fragmentómica también tiene un gran potencial clínico. Debido a la gran relevancia de los análisis de mutaciones en pacientes con cáncer y el efecto de confusión de las variantes relacionadas con la hematopoyesis clonal, el análisis fragmentómico podría permitir una distinción de estos tipos de mutaciones. Por último, la perspectiva de utilizar la fragmentómica para la detección temprana del cáncer es muy interesante y prometedora, sin embargo, estas aplicaciones requerirán estudios bien diseñados con un gran número de probandos para establecer una sensibilidad y especificidad precisas y, por lo tanto, no se realizarán como aplicaciones clínicas en los próximos años. .

Dana Tsui: La aplicación clínica más inmediata sería aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección del cáncer y evitar potencialmente la necesidad de pruebas repetidas. La capacidad de informar el tejido de origen se puede utilizar en una prueba de detección temprana del cáncer para identificar la ubicación de un tumor después de que se detecta el cáncer. El conocimiento sobre el contexto de la secuencia de cfDNA también puede permitir el desarrollo de una nueva estrategia de detección que puede mejorar el rendimiento diagnóstico de una prueba basada en cfDNA.


Extracción de ADN libre de células - Biología

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Extracción de ADN libre de células - Biología

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Extracción de ADN libre de células urinarias mediante el uso de partículas de sílice modificadas con triamina para biopsia líquida

La presencia de aproximadamente 200 pb de ADN libre de células (cfDNA) en la orina ha atraído la atención como biomarcador de la biopsia líquida. Sin embargo, actualmente solo es útil para diagnósticos de cánceres en los que se excreta una gran cantidad de cfDNA en la orina. Por lo tanto, el desarrollo de un método eficaz para extraer el cfDNA existente en pequeñas cantidades en la orina es esencial para diagnosticar muchas otras enfermedades. Examinamos el efecto del tamaño de las partículas, el tamaño de los poros pequeños (área superficial) y la modificación de la superficie de las partículas de sílice porosa sobre la eficiencia de la extracción de ADN. Nuestras observaciones sugirieron que el cfDNA podría ser capturado por partículas modificadas con amina terciaria y luego eliminado de las partículas lavando repetidamente con bicarbonato de sodio (pH 11). Usando este método con 30 mg de partículas modificadas con triamina, logramos extraer unos cientos de nanogramos de cfDNA de 15 ml de orina. Además, pudimos detectar

67 fg / mL de ADN de caries (211 pb) en una muestra de orina de 15 mL, lo que sugiere que este método puede ser adecuado para la extracción de biomarcadores genéticos para biopsia líquida basada en cfDNA.

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Resultados

Extractos celulares brutos preparados mediante tratamiento con lisozima y congelación-descongelación (extracto celular LoFT)

mi. coli las células tratadas con lisozima son frágiles y se rompen fácilmente por choque osmótico o ciclos de congelación-descongelación. Por lo tanto, combinamos estos procedimientos para preparar extractos de células altamente concentrados, como se describe en la Fig. 1A. Una cultura L de mi. coli células en fase logarítmica tardía (OD600 = 1,0-2,0) se trató con lisozima en hielo. Después, las células se lavaron con sacarosa 400 mM y se resuspendieron en DDW. Las células se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron gradualmente en agua helada y los sobrenadantes de las células tratadas se recogieron por centrifugación. Debido a que los sedimentos eran muy viscosos, los sobrenadantes se recogieron cuidadosamente. Los extractos de células resultantes, obtenidos mediante tratamiento con lisozima, choque osmótico y congelación-descongelación (extracto de células LoFT), por lo general contenían 20 a 30 mg / ml de proteínas.

(A) Un protocolo típico para preparar el extracto de células LoFT. (B) Tinción de Coomassie después de SDS-PAGE, que muestra la expresión de GFP y FtsZ (un homólogo de tubulina bacteriana) utilizando el protocolo de extracción de células LoFT. pOR2OR1-sfGFP (gfp bajo el control del promotor OR2-OR1), pET29-sfGFP (gfp bajo el control del promotor T7), o pET29-ftsZ (ftsZ bajo el control del promotor T7) se mezcló el plásmido con extracto de células LoFT y mezclas de reacción y se incubó durante 14 ha 29ºC. La expresión de FtsZ se confirmó usando un FluorTect GreenLys in vitro sistema de etiquetado de traducción (Promega, Fitchburg, WI).

Los extractos de células LoFT exhibieron una expresión de proteína eficiente en el sistema CFPS, cuando se combinaron con otros componentes de la mezcla de reacción y ADN plasmídico (Fig. 1B). Por lo general, se sintetizaron aproximadamente 10 a 20 μM (0,25 a 0,5 mg / ml) de sfGFP activa después de una reacción de 14 horas a 29 ° C. Tanto la ARN polimerasa de T7 como endógena mi. coli La ARN polimerasa en el extracto de células LoFT funcionó como maquinaria de transcripción para CFPS (Fig. 1B). La proteína FtsZ, un análogo de la tubulina bacteriana, también fue sintetizada por CFPS usando extracto de células LoFT (Fig. 1B, Fig. S1).

Los niveles de expresión de proteínas estaban casi saturados después de una reacción de 3 h (Fig. S2). Tanto el 3-PGA como la creatina fosfato quinasa pudieron utilizarse como fuentes de energía (Fig. S3), como se informó en otros estudios de CFPS [25-28,30,31].

Condiciones óptimas de congelación-descongelación después del tratamiento con lisozima

Las condiciones de congelación y el número de ciclos son factores importantes para maximizar el rendimiento de proteínas durante la interrupción de la congelación-descongelación. Primero, evaluamos el efecto de las temperaturas bajo cero sobre el rendimiento de proteínas. Las suspensiones celulares se dividieron en seis tubos inmediatamente antes de la congelación, tres tubos se congelaron en un congelador (a -80 ° C) durante 1 h, mientras que los otros tres tubos se sumergieron en nitrógeno líquido (a -196 ° C) durante 15 min. Todos los tubos se descongelaron en agua helada y se recogieron los sobrenadantes (extractos de células) después de la centrifugación. En términos de concentración de proteína, encontramos que la congelación en nitrógeno líquido, en comparación con la congelación a -80 ° C, resultó en un rendimiento de proteína 1,33 veces mayor (Fig. 2A).

(A) Efectos de la temperatura de congelación sobre la concentración de proteínas (concentración de proteínas) después de la congelación-descongelación. Las muestras se congelaron en un congelador (-80 ° C) durante 1 h, sumergidas en nitrógeno líquido (Liq. N2) durante 15 min, o sin congelar. (B) Concentración de proteína (barras grises) en los extractos de células LoFT y volumen de sobrenadante (Sup.) Después de la centrifugación (círculos) en comparación con el número de ciclos de congelación-descongelación. Los volúmenes de sobrenadante recolectables se derivaron de la viscosidad de los desechos celulares después de la congelación-descongelación. Debido a que las desviaciones estándar de la solución coleccionable (n = 3) eran más pequeñas (en la escala que se muestra) que los tamaños de los círculos, no se indican las barras de error. Todas las muestras en (A) y (B) se descongelaron mediante incubación en agua helada, y las barras de error indican la desviación estándar (n = 3).

En segundo lugar, se evaluó el efecto de múltiples ciclos de congelación-descongelación sobre el rendimiento de proteínas. Específicamente, se probaron uno, dos y tres ciclos de congelación-descongelación. El número de ciclos no afectó a las concentraciones de proteínas de los extractos de células LoFT. Sin embargo, múltiples ciclos de congelación-descongelación redujeron el volumen de sobrenadante recolectable después de la centrifugación (Fig. 2B). Por lo tanto, estos resultados indicaron que un solo paso de congelación-descongelación era óptimo para la preparación de extractos de células LoFT cuando se usaba DDW como solución para el choque osmótico.

Efecto de la proporción de agua bidestilada a células húmedas en el rendimiento de proteínas

A continuación, examinamos la relación entre los rendimientos de proteínas y el volumen de DDW añadido antes de la congelación. Se prepararon extractos de células LoFT usando 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 5.0 mL de DDW por 1 g de células húmedas, y se evaluaron sus respectivas concentraciones de proteína y los rendimientos de proteína total.

Los volúmenes más pequeños de DDW condujeron a concentraciones de proteína más altas en los extractos de células LoFT (Fig. S4A). Los rendimientos totales de proteína no fueron iguales entre las diferentes condiciones, y el rendimiento más alto se obtuvo usando 1.5 mL de DDW (Fig. S4B); sin embargo, la concentración de proteína no alcanzó la concentración requerida para CFPS (& gt20 mg / mL). Estos resultados sugieren que la proporción recomendada es 1.0 mL de DDW por 1 g de células, porque este volumen proporciona concentraciones de proteína suficientes para CFPS mientras que los rendimientos de proteína permanecen relativamente altos.

Efecto de la fuerza centrífuga relativa sobre el extracto de células LoFT

La fuerza centrífuga relativa (rcf) es un factor importante para la preparación de extractos de células para CFPS. Por lo general, los sobrenadantes se obtienen después de la centrifugación a 30.000 × gramo durante 30-60 min (S30) nuestros extractos de LoFT se prepararon mediante centrifugación a 25.000 × gramo durante 60 min. Sin embargo, las centrífugas de uso común para tubos de 1,7 ml no suelen generar más de 20.000 × gramo. Hasta la fecha, varios grupos han informado que la centrifugación a 12.000 × gramo es suficiente para recolectar extractos de células después de utilizar métodos de alteración física [26, 30]. Por lo tanto, evaluamos el efecto del rcf en la preparación del extracto de células LoFT. Los niveles de centrifugación se establecieron en 12.000 × gramo y 16.000 × gramo, velocidades que se pueden generar en microcentrífugas típicas. El tiempo de centrifugación se ajustó para lograr niveles iguales de fuerza de centrifugación total (FCR × tiempo), en comparación con 25.000 × gramo durante 60 min. Nuestros resultados demostraron que los rendimientos y concentraciones de proteína extraída fueron similares para todas las condiciones de rcf probadas (Fig. 3). Los CFPS que utilizan extractos de células LoFT preparados a velocidades de centrifugación más bajas exhibieron niveles de actividad comparables a los observados para los extractos obtenidos por centrifugación a 25.000 × gramo durante 60 min.

La concentración de proteína (barras grises) y los niveles de expresión de sfGFP, de CFPS utilizando extractos de células LoFT y pOR2OR1-sfGFP 3 nM (círculos), se representaron frente a las fuerzas de centrifugación (12.000 × gramo durante 2,5 h, 16.000 × gramo durante 94 min y 25.000 × gramo durante 1 h) después de congelar-descongelar. Las barras de error indican desviaciones estándar (n = 3). Los niveles de expresión de sfGFP se normalizaron al valor medio de los extractos celulares obtenidos después de la centrifugación a 25.000 × gramo durante 1 h (eje vertical). GFP exp. significa "expresión de GFP".

Pequeñas moléculas esenciales para CFPS utilizando el extracto de células LoFT

Los métodos para preparar el extracto de células LoFT no incluyen la eliminación de moléculas pequeñas. Nuestros estudios previos sobre extractos de células sin aditivos preparados por sonicación indicaron que los nucleósidos trifosfatos (NTP) y los aminoácidos pueden omitirse de la mezcla de reacción de CFPS [25]. Por tanto, se evaluó la importancia de cada componente en la mezcla de reacción de CFPS en un ensayo de omisión (Fig. 4). Los componentes de nuestra mezcla de reacción fueron ADN molde (gen GFP bajo el promotor OR2-OR1 [27]), NTP, aminoácidos, glutamato de potasio (GluK), acetato de magnesio (Mg), 3-fosfoglicerato (3PGA), tampón HEPES , PEG8000, maltosa, CoA, cAMP, NAD +, tRNA, espermidina y donante de formilo. La omisión de cAMP, NAD + y CoA afectó la eficacia de CFPS, como se informó anteriormente en otro lugar [35]. La importancia del ARNt, la espermidina, el donante de formilo y la maltosa para las CFPS varió entre los diferentes extractos de células LoFT, por lo que no podemos determinar de manera concluyente la importancia de estos productos químicos. Se determinó que otros productos químicos eran indispensables para una CFPS eficiente según el ensayo de omisión (Fig. 4). Estos resultados sugieren que el extracto de células LoFT requiere más especies de metabolitos pequeños para CFPS que el extracto de células sin aditivos preparado por sonicación [25]. Esto podría deberse a la fuga de pequeñas moléculas durante los pasos de lavado después del tratamiento con lisozima.

La importancia de cada producto químico para la expresión de GFP se evaluó por omisión sistemática de las mezclas de reacción. AA indica la mezcla de 20 aminoácidos. El ADN molde utilizado fue pOR2OR1-sfGFP 10 nM. La CFPS se realizó a 29 ° C durante 14 h. En la condición indicada por "todos", no se omitió ninguno de los productos químicos. Las barras de error indican desviaciones estándar (n = 4).

CFPS de fragmentos de ADN lineal utilizando el extracto de células LoFT

Para aplicaciones en biología sintética ascendente, debería ser posible utilizar CFPS a partir de ADN lineal producido por PCR [12]. Informes anteriores han demostrado que la adición de GamS, un inhibidor de la nucleasa RecBCD, permite el uso de ADN lineal como plantilla para este proceso [36]. Confirmamos que el sistema de ADN lineal GamS también funciona con extracto de células LoFT. Fluorescence intensity measurement showed that LoFT cell extract is able to produce GFP, encoded by a linear DNA fragment, in a GamS-dependent manner however, the CFPS activity was several times lower when compared to CFPS performed using circular plasmids (Fig 5A). In addition, protein expression stopped within 1 h (S5 Fig). GamS supplementation slightly, but not effectively, reduced GFP expression in CFPS using circular plasmids (S6 Fig). The lower CFPS activity using linear DNA with the GamS system was also reported in a previous study using S30 prepared by conventional physical disruption [12]. GFP fluorescence after SDS-PAGE without boiling supported these results (Fig 5B).

sfGFP was produced using LoFT cell extract and 5 nM linear DNA (PCR product) for 1 h at 29°C, in the absence (−) or presence (+) of 4 μM GamS. OR and T7 indicate PCR products from the OR2OR1-sfGFP (from the pOR2OR1-sfGFP plasmid) and T7-sfGFP (from the pET29-sfGFP plasmid), respectively. Prom. means “Promoter”. (A) Expression levels of GFP estimated by total fluorescence levels. Error bars indicate standard deviations (n = 3). (B) GFP fluorescence detected using SDS-PAGE without boiling. Only bands corresponding to GFP fluorescence are shown.

Small molecules in the LoFT cell extract could be exchanged with buffer

The procedure to prepare LoFT cell extract does not require any buffers. However, the use of a buffer could perhaps improve the efficiency of CFPS. To address this point, we tested if buffer exchange, after preparation of LoFT cell extract, could improve CFPS efficiency. After small molecules in the LoFT cell extract were exchanged with CFPS buffer (5 mM Tris-HCl pH 7.6, 60 mM potassium glutamate, 14 mM magnesium acetate), the activity was assayed using GFP as a reporter. The omission assay revealed that the dependence on added chemicals, for CFPS activity, was quite similar to that of extracts without buffer exchange, with the exception of PEG8000 (Fig 6).

The importance of each chemical for GFP expression was evaluated by systematic omission from the reaction mixtures. AA indicates the mixture of 20 amino acids. pOR2OR1-sfGFP (10 nM) was used as the DNA template. CFPS was performed at 29°C for 14 h. “all” indicates no chemicals were omitted. Expression levels of sfGFP were normalized to the average value of “all.” Error bars indicate standard deviation (n = 4). Expression of sfGFP without GluK and Mg is a result of the exchange buffer (S30 buffer) containing these chemicals.

We also tested the effect of LoFT cell extraction using buffers, instead of DDW, on CFPS. DDW at the last suspension step was replaced with S30 buffer (see Materials & Methods). Because several hundred microliters of cell suspension was used, this replacement slightly decreased protein concentrations after centrifugation. In addition, the supernatant obtained after a single freeze-thaw cycle showed reduced CFPS activity (S7 Fig). Interestingly, CFPS activity was recovered in supernatants that underwent two freeze-thaw cycles (S7 Fig). However, we also found that a single freeze-thaw cycle was sufficient when CFPS buffer was used at a volume of 1.5 times the cell mass.


Phenotypes from cell-free DNA

Cell-free DNA (cfDNA) has the potential to enable non-invasive detection of disease states and progression. Beyond its sequence, cfDNA also represents the nucleosomal landscape of cell(s)-of-origin and captures the dynamics of the epigenome. In this review, we highlight the emergence of cfDNA epigenomic methods that assess disease beyond the scope of mutant tumour genotyping. Detection of tumour mutations is the gold standard for sequencing methods in clinical oncology. However, limitations inherent to mutation targeting in cfDNA, and the possibilities of uncovering molecular mechanisms underlying disease, have made epigenomics of cfDNA an exciting alternative. We discuss the epigenomic information revealed by cfDNA, and how epigenomic methods exploit cfDNA to detect and characterize cancer. Future applications of cfDNA epigenomic methods to act complementarily and orthogonally to current clinical practices has the potential to transform cancer management and improve cancer patient outcomes.

1. Introducción

Blood is a minimally invasive source for tracking an individual's health status. Most known biomolecules found in blood, such as proteins, DNA, RNA, lipids, and metabolites inform us of some aspect of body function. However, using blood to diagnose and track cancer is still a major challenge. Minimally invasive diagnostics for cancer can greatly reduce pain and suffering of patients, and if cheaper than current methods, could be performed more often in the course of treatment to monitor disease state and inform clinical care. Genomic characterization of cancer either from biopsies or plasma cell-free DNA (cfDNA) has the added potential of providing personalized treatment options.

cfDNA is DNA bound to mononucleosomes and is found circulating extracellularly in the blood. cfDNA was first identified in 1948 [1] in the blood of patients however, the hypothesis that cfDNA acts as a reflection of disease state arose from observations in 1977 [2]. This relationship between cfDNA and disease has been a subject of study ever since. There are multiple possible pathways for the release of DNA fragments from cells, including apoptosis, necrosis, and exosome secretion [3–6]. Processes that increase the release of cfDNA include disease, inflammation, tissue injury, and exercise [7,8]. In healthy individuals, haematopoietic maturation is a major contributor to the normal cfDNA pool. Lui et al. elegantly demonstrated that lymphoid/myeloid tissues are the major contributors to cfDNA by identifying Y-chromosome sequences in plasma of female recipients of bone marrow transplantations from male donors [9]. Multiple studies since then further confirmed that the lymphoid/myeloid tissues mainly contribute to the normal cfDNA pool [10–13]. Tumours, when present, also contribute to cfDNA. Thus, cfDNA is a molecular barcode of cells undergoing turnover and is an attractive target for clinical diagnostics and real-time monitoring of many cancers.

Provided that there are ways to distinguish cfDNA originating at the disease site from cfDNA produced during normal turnover, cfDNA could be used for diagnosis. The major focus of using cfDNA for cancer diagnosis has been the identification of a limited disease-specific panel of mutations. However, mutation detection has a significant limitation: that clonal haematopoiesis contributes to a significant fraction of mutations in cfDNA, including mutations in prominent cancer-associated genes like TP53 and DNMT3A [14]. Moreover, these mutations in cfDNA from the early stages of disease can be indistinguishable from mutations that arise at appreciable rates in healthy tissues [15,16]. This major obstacle has led to the exploration of other orthogonal information in cfDNA that could identify its tissue-of-origin and, in turn, disease states. Epigenomes reflect cellular identity and phenotype, and our ability to connect epigenomes to cellular identity could be used to infer disease phenotypes from cfDNA. Significantly, epigenome-based cfDNA approaches would be orthogonal and complementary to mutation-based cfDNA assays. In this review, we discuss epigenome features that can be characterized in cfDNA, and which provide information on the cfDNA tissue-of-origin.

2. Cell-free DNA contains a map of the chromatin state in the tissue-of-origin

The periodicity of cytoplasmic DNA released during red blood cell maturation in mouse fetal liver led to the hypothesis that there was a regular arrangement of protein protections on the genome [17,18]. This work preceded both the field of apoptosis and the biochemical characterization of the nucleosome and provided the first hint that cfDNA could be a map of chromatin structure. Protein-bound DNA lasts longer than naked DNA in serum [19], where nucleases are abundant, which suggests that cfDNA is probably double-stranded and protein-bound to inhibit degradation by endogenous nucleases in plasma. This is supported by the ability to detect nucleosomes in plasma by sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and by chromatin immunoprecipitation (ChIP) [20–24].

Apoptosis is one of the processes that could lead to genome fragmentation into small protein-DNA complexes that are found in circulation. Apoptosis involves the upregulation of nucleases that attack the cell's genome. Characteristic of this ‘attack' is DNA fragmentation that results in a laddering of repeat species less than 5 kb [5,25]. The repeating unit in laddering seen in apoptosis corresponds to approximately 150 bp, which parallels the length of DNA wrapped around a nucleosome. Therefore, plasma cfDNA, which is typically in the form of a mononucleosome, informs us about the chromatin structure of cells undergoing turnover. In other words, the ‘epigenome' of the tissue-of-origin can be measured from cfDNA (figure 1).

Figure 1. Cell-free DNA reflects the structural epigenomic information of the cell-of-origin. Schematic of the nucleosomal landscape differences of gene X when it is not expressed (left) and expressed (right) in different cell-types. (a) A non-expressed gene features promoter-proximal DNA methylation (red flags), methylation of nucleosomal histone tails (red flags, H3K27me3), nucleosome occlusion of the promoter (arrow), a lack of transcription factors (TFs) upstream of the promoter, and the absence of RNA polymerase II (RNAPII). (B) At expressed genes, nucleosomes are well-positioned, modifications like H3K4me3 (green flags) are present, RNAPII occupies the promoter, and TFs are bound upstream. At the +1 nucleosome during transcriptional elongation, RNAPII transiently breaks DNA-histone contacts allowing H2A-H2B dimers to exchange (light blue crescent). Nucleases, shown as scissors, are ubiquitously present and preferentially cleave accessible DNA. At gene X, when protein protections of DNA change during chromatin remodelling events, such as transcription, nuclease activity captures the different DNA length protections (see fragment lengths). (C) During cell-turnover, DNA-protein complexes are released into circulation. (D) Circulating DNA-protein complexes in plasma preserve the epigenomic features of the transcriptional status of the cell-of-origin. These features include fragment lengths (protein-DNA protections), DNA methylation, nucleosome positioning profiles, and nucleosome post-translational modifications. Note the preservation of these transcriptional and non-transcriptional DNA-protein species from in the body to plasma.

3. Structural epigenomics

It has long been known that chromatin structure in cells can be inferred from digestion patterns of nucleases that are sensitive to protein-DNA contacts [26]. Micrococcal nuclease (MNase) has been used to study chromatin structure for decades [27]. Understanding chromatin structure by sequencing fragments protected from MNase digestion has an unexpected parallel in cfDNA. The information derived from fragment length and genome location can inform us of biochemical activity at a genomic locus for MNase and cfDNA. For cfDNA, this can be used to infer transcriptional activity and tissue-of-origin. As we will demonstrate below, the length and genomic location of fragments protected from a nuclease can tell us the locus-specific distribution of nucleosomes, transcription factors (TF), and nucleosomal intermediates formed during transcription (figure 1). The ability to identify locus-specific structures of protein-DNA complexes from sequencing data, termed ‘structural epigenomics', is a general strategy applicable to a wide variety of datasets, including cfDNA sequencing datasets [11].

4. Nucleosome positions reflect genome function

Eukaryotic genomic DNA is packaged with nucleosomes like ‘beads on a string' and consecutive nucleosomes are separated by short linker DNA [28,29]. MNase preferentially degrades linker DNA and is inhibited when it encounters a protein-DNA contact [27,30]. A nucleosome protects 147 bp of DNA, a chromatosome (nucleosome with a linker histone bound) protects 167 bp of DNA, and TFs protect less than 50 bp of DNA. MNase has traditionally been used to map positions of whole nucleosomes in intact nuclei by purifying approximately 147 bp DNA after MNase digestion and subjecting this DNA to massively parallel short-read sequencing [31]. Nucleosome positioning impacts all biochemical processes that occur on the genome and consequently, knowing nucleosome positions enables us to predict biochemical activities that occurred in the cells that resulted in these protections [32]. A striking example of a distinct nucleosome organization is found in active genes. There is a depletion of nucleosomes at active promoters and nucleosomes are well-ordered upstream and downstream of active promoters. cfDNA contains information on nucleosome positioning and high-quality nucleosome maps were obtained from deep, whole-genome cfDNA sequencing from the plasma of healthy donors [12,33–35].

Nucleosome density inferred from cfDNA of healthy individuals had the same features as that of lymphoid cell lines: genes highly expressed in lymphoid cell lines featured nucleosome depletion at promoters and ordered nucleosome positions upstream and downstream of the promoter in cfDNA (figure 1). By contrast, genes that were not expressed in these cell lines showed significant nucleosome density over the promoters and lack of ordering over gene bodies in cfDNA [12,35]. These observations strongly validated the lymphoid/myeloid origin of cfDNA in healthy humans.

Quantitative scores were developed based on these striking observations to connect nucleosome profiles to gene activity in the cfDNA tissue-of-origin. Snyder et al. showed that stronger periodicity of nucleosomes in the gene body (the region between the transcription start site (TSS) and TSS+5000 bp) correlated with higher gene expression in lymphoid/myeloid tissues for healthy donors [12]. However, in cfDNA from donors with cancer, the correlation of nucleosome periodicity at gene bodies with gene expression of lymphoid/myeloid tissues was much weaker, suggesting other cell types contributing to the cfDNA pool. This was confirmed by the fact that the correlation of periodicity with gene expression of other cell types increased for donors with cancer [12]. Thus, nucleosome periodicity could inform the gene expression of the cfDNA tissue(s)-of-origin.

Ulz et al. noted that overall nucleosome density was lower in 2 kb upstream and downstream of the TSS (which they termed ‘2 K-TSS') and lowest at the promoter itself (usually termed the ‘nucleosome depleted region', NDR) in expressed genes in both MNase-seq of a lymphoblastoid cell line and the cfDNA sequencing data from healthy donors [35]. They developed a model that used the nucleosome occupancy at 2 K-TSS and NDR to predict gene expression. In a person with cancer, tumour-contributed cfDNA would have a depletion of nucleosomes at active genes, but this depletion may be masked by high nucleosome occupancy in cfDNA from lymphoid/myeloid tissues. Ulz et al. circumvented this problem by focusing on regions in the genome that featured copy-number gains in cfDNA of donors with cancer. These genomic regions would have a higher representation in tumour cfDNA if the tumour was the source of these copy number gains. Their simulations suggested that at least 75% of cfDNA at a given TSS must be released from tumour cells to infer expression status using their method. In the regions of copy number gain, they demonstrated significant changes in nucleosome occupancy at 2 K-TSS and NDR that correlated with increased expression of these genes in the tumour as assessed by RNA-seq of matched tumour biopsy samples. Thus, promoter and gene-body depletion of cfDNA fragments are indicative of gene activity in the tissue-of-origin of cfDNA.

5. Subnucleosomes in cell-free DNA inform expression state of genes

Transcription also results in the formation of subnucleosomes proximal to the promoter and identification of subnucleosomes could serve as a proxy for measuring gene activity. In eukaryotic cells, transcription occurs on a chromatin template. Because RNA polymerase II (RNAPII) needs to unwind the DNA strands to make RNA, every protein-DNA contact in its path needs to be disrupted. In vitro, nucleosomes present a substantial barrier to transcription elongation [36,37], resulting in specific stalls by RNAPII at sites of strong histone-DNA contacts. In cells, we can map the positions where RNAPII stalls with base pair-resolution maps of the 3′ ends of nascent transcripts [38–41]. These maps have shown that the first nucleosome downstream of TSS (+1 nucleosome) presents a strong barrier to RNAPII in cells.

The effect of RNAPII stalling on the +1 nucleosome could be understood by mapping intermediate nucleosome states during transcription elongation. With sequencing library protocols that capture all fragment lengths combined with paired-end sequencing, the full spectrum of fragments generated by MNase treatment of nuclei can be uncovered [11,42–44]. Fragments between 50 and 147 bp are too short to be protected by a whole nucleosome, but too long to be TF footprints. These intermediate-length protections represent a discrete loss of contacts asymmetrically from either side of the nucleosome as it unwraps during transcription and remodelling (figure 1). Correlating a base-pair resolution map of RNAPII with the high-resolution distribution of nucleosomal intermediates at the +1 nucleosome revealed that nucleosome unwrapping occurs in a stepwise manner—first, the contacts to the H2A-H2B dimer proximal to the promoter are lost. Then as RNAPII elongates through the nucleosome, contacts to the H2A-H2B dimer distal to the promoter are lost [11]. Cryo-electron microscopy of unwrapped nucleosomes and of RNAPII transcribing nucleosome templates yielded structures that matched the en vivo structures inferred from paired-end sequencing [45–47]. These observations highlight the ability of genomic sequencing of short DNA fragments to detect transcription-dependent substructures of nucleosomes in cells.

cfDNA is highly nicked and nicked DNA is lost in standard double-stranded library preparation protocols. Inspired by methods used in Neanderthal genome sequencing projects, Snyder et al. used a single-stranded library protocol (SSP) that captures both nicked and non-nicked fragments [12,48]. Surprisingly, they found an abundance of fragments less than nucleosomal size, ranging from approximately 40 bp onwards. These short fragments resemble subnucleosomes observed in MNase sequencing data from Drosophila cells [11]. When the subnucleosomal cfDNA fragments were mapped at +1 nucleosome positions of genes expressed in lymphoid/myeloid tissues, the same asymmetric unwrapping intermediates that were seen in Drosophila cells could also be observed in the cfDNA data [11]. Thus, it seems that the long residence time of RNAPII near the +1 nucleosome results in long-lived nucleosomal intermediate states that are mappable both by MNase, and by the endogenous nucleases that give rise to cfDNA.

En Drosophila cells, it was found that the amount of the subnucleosomal particles relative to nucleosomal particles at the +1 nucleosome of a gene correlated with the extent to which that gene was transcribed [11]. Therefore, it was hypothesized that the amount of these intermediates relative to whole nucleosomes (subnucleosome enrichment) at the +1 nucleosome of genes in cfDNA would correlate with the composite expression profile of cells giving rise to cfDNA. Indeed, in a healthy donor, cfDNA subnucleosome enrichment correlated much better with expression profiles of lymphoid/myeloid tissue types compared to other tissue types. However, in donors with cancer, the subnucleosome enrichment corresponding to lymphoid/myeloid tissues weakened substantially, enabling robust differentiation of healthy and cancer plasma cfDNA [11]. Thus, subnucleosomes in cfDNA represent relics of transcription in cfDNA tissues-of-origin that can inform us about the transcriptional programmes active at disease sites.

6. Chromatin structure correlations across megabases

The observation that nucleosome dynamics are reflected by shorter protections in cfDNA can be extended to much larger length scales than single nucleosomes, which allows maximal use of low depth cfDNA sequencing data. Using a machine learning model, Cristiano et al. were able to observe similar ‘fragmentation profiles' at megabase scales between cfDNA from healthy donors and the DNA released by MNase treatment of healthy lymphocytes [49]. Fragmentation profile is a measure similar to subnucleosome enrichment: a ratio of small fragments (100–150 bp) to large cfDNA fragments (151–220 bp). A significant difference in fragmentation profiles was observed between cfDNA from healthy donors and donors with cancer, enabling detection of cancer with low-depth whole-genome cfDNA sequencing. This method works presumably because fragmentation profiles at large length scales differentiate active domains of the chromosome from inactive domains. A tumour is expected to have significantly different active chromatin domains at the megabase scale compared to lymphoid/myeloid tissues.

A similar hypothesis is that the strength of correlation of cfDNA length profiles between genomic loci is proportional to the correlation of contacts made by the loci to the rest of the chromosome [50,51]. The correlation matrix of contact probability for a cell type can be obtained by Hi-C [52]. The Hi-C method involves crosslinking cells, fragmenting the genome into large pieces with the crosslinks intact, and then ligating the cross-linked fragments. Sequencing of the ligated contacts reveals chromatin contacts genome-wide. Regions of the genome with similar activity share similar contact profiles across the chromosome. Liu et al. showed that the strength of correlation of healthy cfDNA length profiles between different genomic regions is proportional to the strength of correlation of Hi-C contacts between different genomic regions as measured in lymphoblastoid cells. Furthermore, this correlation of cfDNA length profiles between different regions of a chromosome could be modelled as a combination of Hi-C maps of different tissue types to uncover tissue contributions to cfDNA in tumour samples with high (greater than 30%) tumour fractions [50]. Thus, cfDNA profiles could be used to infer chromosome contacts in the tissue(s)-of-origin.

7. Distinct cell-free DNA patterns at transcription factor binding sites

TF binding sites at promoters, enhancers, and insulators show enrichment of short protections (less than 50 bp) and depletion of nucleosomes in MNase-seq experiments [11,42,43,53–55]. Binding of many TFs also results in the ordering of nucleosomes around the TF binding sites [56]. Thus, protected TF binding sites represent a discrete class of genomic loci that show distinctive chromatin structural profiles in nuclease-protection assays. The enrichment of short fragments in cfDNA using SSP enabled Snyder et al. to observe similar enrichment of short protections and ordered nucleosome arrays at TF binding sites in cfDNA datasets from healthy plasma. They also observed an enrichment of short fragments in cfDNA at promoters that was proportional to expression levels of a lymphoid cell line, demonstrating the ability to possibly identify transcriptional complexes at a promoter from cfDNA [12].

Ulz et al. found that mononucleosome depletion observed in cfDNA at known TF-binding sites (TFBSs) is a good proxy for inferring TF binding [57]. This enables inference of TF binding from cfDNA sequenced using standard double stranded protocols that do not enrich for short fragments. They selected a set of TFs which are lineage-specific, for example, Androgen Receptor (prostate), Even-Skipped Homeobox 2 (colon), Forkhead box A1 (breast), and for each of them, profiled 1000 binding sites that were concordant across tissue samples [58]. Using plasma from patients with prostate, breast, and colon cancer, they showed that nucleosome depletion levels at binding sites of tumour-specific TFs are significantly higher compared to healthy cohorts and the reverse was true at binding sites for haematopoietic lineage-specific TFs such as LYL1, and EVI1. In addition, they also showed that nucleosome depletion levels at specific TFBSs were predictive of tumour subtypes. For instance, they found a significant reduction in nucleosome depletion at Androgen Receptor-binding sites when comparing samples from before and after a patient's prostate adenocarcinoma became androgen-independent. Thus, TF binding can be inferred from cfDNA either directly through short fragment protections when using SSP or indirectly via nucleosome depletion at TFBSs when using standard double-stranded library protocols and tissue-specific TFBSs enable identification of tissues that contribute to cfDNA.

8. Cell-free DNA fragment length

As we have discussed above, cfDNA length reflects the structure of chromatin in cells of origin and can be explicitly modelled as such. Beyond trying to understand cfDNA profiles in terms of chromatin structure, there have been several useful observations about the use of cfDNA length in biomarker development, for which we can only speculate the underlying molecular details. At its most general, the size of cfDNA fragments is used to delineate between baseline homeostasis and other biological phenomena that give rise to cfDNA. cfDNA has already been directly applied in the clinic for pre-natal testing. In plasma, fetal cfDNA is shorter than maternal cfDNA [13,59,60], which enables detection of aneuploidy or recessive disorders in the fetus non-invasively. Urine cfDNA features short periodic fragments that resemble subnucleosomes [51]. In individuals with cancer, circulating tumour DNA resides in the shorter cfDNA fraction [61–63]. The frequency of shorter, non-tumour cfDNAs is typically low and thus size selection for shorter fragments could dramatically increase the sensitivity of detection for mutant tumour cfDNA. Mutation targeting and identification of copy number variation and/or single copy number alterations is achieved with a higher sensitivity if the shorter cfDNA fraction is profiled [61,62]. This is a consequence of mutant tumour cfDNA being diluted less with non-tumour cfDNA in the shorter fraction. In the light of these observations, one prediction is that shorter cfDNA is a product of a specific mechanism that occurs at a higher frequency in fetal cells, cells that give rise to cfDNA in urine, and cancer cells relative to normal lymphoid/myeloid cell turnover.

9. Cell-free DNA chromatin immunoprecipitation uses cell type-specific genome-wide patterns of histone modifications to identify tissues of origin

Several studies in the early 2000s used ELISA to capture and calculate the concentration of nucleosomes in plasma [20,22–24,64,65]. Specifically, nucleosomes were captured in an antibody ‘sandwich', which used an antibody for a histone and an antibody for double-stranded DNA. This approach was an alternative means to assess cell death using plasma from cancer patients. In a notable study, cancer patients exhibited a statistically significant increase in nucleosome concentration compared to healthy individuals [20]. These findings suggest that nucleosome concentration could act as a biomarker for a disease state and/or discriminate between individuals with disease and those who are healthy. However, this application lacks specific genomic information to identify the tissue-of-origin and specify the disease state.

Beyond differences in overall nucleosome concentrations among physiological states, an intriguing question is if post-translational modifications (PTMs) of nucleosomal histones in plasma can be used to differentiate healthy individuals and those with disease (figure 1). PTMs of nucleosomal histones and DNA differ in euchromatic regions versus heterochromatic regions [66,67]. PTMs range from small chemical groups to larger proteins, such as ubiquitin, that are added to specific amino acids of proteins. For example, tri-methylation of histone 3 lysine 27 (H3K27me3) or H3K9me3 are found at heterochromatic regions where gene activity is repressed or ‘silent'. By contrast, H3K4me3 or H3K36me3 are associated with euchromatic regions where genes are active [68,69].

The link between cancer and chromatin regulation is well documented [70]. The majority of oncogenic mutations occur in genes of chromatin modifiers [71–73], which include a number of tumour-suppressor genes, such as SIRT1 [74]. Genomic instability is a hallmark of cancer and a consequence of alterations in heterochromatin that disrupt silencing [75,76]. Deligezer et al. analysed histone PTMs on circulating nucleosomes in plasma [22]. In light of the evidence for deregulation of repressive PTMs associated with gene silencing in cancer, histone methylation, specifically H3K9me1, was first assessed on circulating nucleosomes from myeloma patient plasma samples. Follow-up papers identified a reduction in repressive chromatin marks (H3K9me3, H4K20me3 and H3K27me3) in patients with colorectal cancer and metastatic prostate cancer [22,23]. However, these studies did not use high-throughput sequencing technology that would provide information on the genomic locations of histone PTMs an aspect that is important to consider when delineating between different physiological states (i.e. disease and non-disease states) that produce changes in PTM levels in circulating nucleosomes.

A recent study sought to assess circulating post-translationally modified nucleosomes in a variety of physiological states using a combination of ChIP and next-generation sequencing [21]. The authors created a workflow to isolate modified circulating nucleosomes from plasma and performed high-throughput sequencing of the associated DNA (cfChIP-seq). Modified nucleosomes containing PTMs associated with active genes or cis-regulatory elements (i.e. enhancers) were specifically targeted: H3K4me1/2/3 and H3K36me3. H3K4me3 cfChIP-seq signal was used as a proxy for active genes and recapitulated earlier findings that cell-type specific gene activation programmes belonged to mainly blood lineages in a healthy individual. Furthermore, the cfChIP-seq signals reflected previously identified ChIP-seq signals for PTMs in these lineages.

This analysis was extended to profile patients with a variety of physiological insults, including surgery and cancer. cfChIP-seq detected differences in gene expression in individuals with cancer compared to healthy individuals. In response to surgical interventions, changes in tissue-specific cfChIP-signatures were detectable in the blood of patients supporting tissue-of-origin specificity. Combinations of PTMs were also assessed for complementary information to further profile tissue-type specific gene activity from non-coding regions. The authors observed changes in H3K4me2 (found at putative enhancer elements) and H3K36me3 (found within the body of transcribed genes) that correlated with differential gene activity unique to cancer tumours. Overall, the ability to identify the tissue-of-origin based on enrichment of circulating nucleosome PTMs associated with transcription at specific regions of the genome is exciting. cfChIP-sequencing provides an additional layer of information about an individual's underlying physiological state derived from the blood.

10. Cell-free DNA methylation patterns identify tissues of origin

Methylation of cytosines in the CpG dinucleotide context is associated with cellular identity [77] and can be identified on cfDNA [78,79]. Deamination of cytosine to uracil using sodium bisulfite or using an antibody specific to CpG methylation to pulldown methylated DNA are the two main methods used to map CpG methylation genome wide. Often promoter hypermethylation of a gene is associated with silencing [79]. DNA methylation profiles are stable and cell-type specific, and differentially methylated regions (DMRs) have been extensively used in quantification of subpopulations in DNA extracted from heterogeneous cell populations [80,81]. Accomando et al. showed that cell-types in leucocytes can be quantified using methylation status at as few as 20 CpG loci [82]. Many genomic locations exhibit highly cell-type specific DNA methylation, which has been instrumental in developing computational methods to delineate the contribution of tissues to cfDNA. CpG islands, a region 300–3000 bp in length and rich in G + C content, are usually hypomethylated, but aberrant methylation of these regions is associated with diseases like cancer [83]. Some CpG islands share high methylation levels across tumour types, while others are tumour specific [84]. Promoter hypermethylation of tumour suppressor genes is especially a striking feature of tumours particularly during carcinogenesis [85,86]. Targeted amplification of candidate promoter regions has been used to find that cfDNA from cancer patients exhibit hypermethylation in contrast to healthy donors [87–89]. Using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP-seq) optimized for low DNA amounts, Shen et al. detected numerous DMRs in cfDNA from individuals with cancer that are specific to tumour tissue-of-origin [90]. In particular, they showed that plasma DMRs in individuals with colorectal cancer closely matched solid tumour-derived DMRs. Thus, tissue-specific methylation patterns and hypermethylation of tumour suppressor genes can be used as signatures to detect cancer as well as identify cfDNA tissue(s)-of-origin [91].

11. Conclusion/future perspectives

The remarkable observation in 1970 that hinted at a relationship between cytoplasmic DNA and the chromatin structure of the cell-of-origin now underlies the conceptual paradigm of cfDNA epigenomics [18]. As there is an increasing awareness of the limitations associated with detecting and identifying diseases, such as cancer, solely based on mutant genotypes, the emergence of cfDNA approaches based on epigenomics provides a valuable alternative (figure 2). Chromatin remodellers, chromatin-modifying complexes and DNA methyltransferases are frequently dysregulated in cancer highlighting the relationship between chromatin regulation and oncogenesis [92–97]. Furthermore, simulations show that using hundreds of features throughout the genome (which would be the case for epigenomic features) improves the limit of detection of disease states from cfDNA compared to a few features (which would be the case when looking for tumour mutations) [49,90]. Combining epigenomic assessments with mutation-based targeting may better guide personalized treatment of cancer patients rather than solely relying on one method.

Figure 2. Clinical applications for cancer patients using epigenomic features of cell-free DNA.

Early detection of cancer still remains a challenge for all cfDNA-based methods. An early cancer diagnosis increases a patient's chance for curative treatment. However, tumour shedding of DNA into the blood is at a lower concentration in early stages than what is observed in advanced cancer stages. Most methods described above have been used on samples of advanced cancer patients indicating a much-needed effort to examine their use and sensitivity for early detection. However, significant in-roads are being made. A recent multi-centre, randomized study used cfDNA methylation analysis to prospectively assess the largest cohort (norte = 6689, 4207 healthy and 2482 cancer) to date for early detection and localization of more than 50 types of cancers [91]. With 99.3% specificity, the sensitivity increased as cancer stage increased (Stage I: 18%—Stage IV: 93%), with tissue-of-origin predicting cancer in 96% of samples with an accuracy of 93%. These are promising results for the future development of a cancer screening test for the general population. With improvements over time, cfDNA epigenomic methods described in this review can be combined with current clinical practices to improve detection of cancer in patients.

Obtaining molecular signatures of cancer based on epigenomic features highlights the variety of information contained in the blood of an individual. The studies we reviewed here represent an orthogonal network of disease-specific epigenomic information that is rich for exploitation. Combined with current clinical molecular diagnostics, the timely emergence of epigenomic cfDNA methods herald a chance to revolutionize disease management, specifically cancer. One can envision the successful implementation of these approaches to help guide personalized medicine at different stages of disease beginning with diagnosis and throughout the course of treatment. Beyond biomarkers, diverse epigenomic cfDNA methodologies also provide the opportunity to directly investigate the molecular mechanisms underlying pathology in humans.


Ver el vídeo: Análisis de saliva vs análisis de sangre (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Aethelfrith

    Ahora todo me quedó claro, gracias por su ayuda en este asunto.

  2. Montrelle

    Es notable, la pieza útil.

  3. Alphonsus

    Perdón por intervenir, yo también quiero expresar la opinión.

  4. Croften

    Disculpa, que te interrumpo.

  5. Macnab

    Sí, en serio. Me uno a todos dijeron anteriormente. Podemos comunicarnos sobre este tema. Aquí o en PM.



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